本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌PV-殺白細(xì)胞素（PVL）對(duì)多形核粒細(xì)胞的影響　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是危害人民生命健康的超級(jí)細(xì)菌,產(chǎn)PV-殺白細(xì)胞毒素(PVL)的MRSA毒力增強(qiáng),危害更廣,可引起社區(qū)人群的嚴(yán)重感染。臨床研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)PVL的MRSA所引起的壞死性肺炎病情進(jìn)展快,治療困難,死亡率高,常伴有多核形粒細(xì)胞(PMNs)在呼吸道表面聚集,發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),但其機(jī)制尚不清楚。本課題將誘導(dǎo)含重組表達(dá)載體的宿主菌表達(dá),純化獲得重組PVL蛋白(rPVL),觀察rPVL對(duì)人PMNs的殺傷作用,探討rPVL對(duì)PMNs細(xì)胞因子IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)的影響,并探討其胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路,同時(shí)研究rPVL對(duì)不同種屬來(lái)源的PMNs的殺傷作用,為闡釋PVL的致病機(jī)制,尋求治療PVL相關(guān)肺損傷的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。 方法:(1)異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)含重組表達(dá)載體的大腸埃希菌(E.coli) BL21(DE3)株,純化后獲得可溶性重組蛋白,Western blot對(duì)其鑒定。(2)從正常人外周血分離PMNs,分別加入6nmol/L,100nmol/L rPVL蛋白,共同孵育6h,臺(tái)盼蘭染色觀察細(xì)胞活力,瑞氏吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài),透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡/壞死率。同時(shí),分離人、新西蘭白兔、BALB/c小鼠、C57/ BL6小鼠的PMNs,分別加入PBS和20nmol/L rPVL蛋白,共同孵育4h,臺(tái)盼蘭染色觀察細(xì)胞活力,瑞氏吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡/壞死率。(3)收集細(xì)胞,提取總RNA,應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞IL-6、IL-8、TNF-α、TLR2、TLR4、CD14 CXCR4及NF-κB p65 mRNA表達(dá)。同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-8及TNF-α濃度變化。 結(jié)果:(1)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后, SDS-PAGE鑒定可獲得到與預(yù)期分子量相符的表達(dá)產(chǎn)物。親和層析法純化的rPVL-F和rPVL-S,經(jīng)Western-blotting鑒定,能夠被鼠源性抗His抗體識(shí)別。(2)rPVL作用后,臺(tái)盼蘭染色可見(jiàn)人、新西蘭白兔及BALB/c小鼠的PMNs著色細(xì)胞增多,瑞氏吉姆薩染色可見(jiàn)細(xì)胞中出現(xiàn)不規(guī)則團(tuán)塊樣物,核固縮,細(xì)胞形態(tài)縮小,部分細(xì)胞胞漿可見(jiàn)空泡,核碎裂。電鏡檢查可見(jiàn)rPVL作用后,細(xì)胞核固縮,胞漿空泡增多,并可見(jiàn)凋亡小體。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),相較之于PBS對(duì)照組,rPVL組細(xì)胞凋亡率和壞死率均明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而C57/BL6小鼠的PMNs在rPVL作用前后,細(xì)胞活力、形態(tài)學(xué)及凋亡和壞死率均無(wú)變化。(3)rPVL作用PMNs后,細(xì)胞因子IL-6、IL-8及TNF-α濃度及mRNA表達(dá)量明顯增加,且隨著濃度升高,增加更為明顯。PMNs TLR2、TLR4及其相關(guān)信號(hào)通路分子CD14、CXCR4 mRNA表達(dá)量均增高。同時(shí),PMNs NF-κB p65 mRNA表達(dá)量也明顯增高。 結(jié)論:(1)成功建立了PVL基因高效表達(dá)體系,經(jīng)親和層析純化法可獲得重組蛋白,為研究PVL分子致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。(2)rPVL對(duì)人PMNs具有特異性殺傷作用,可誘導(dǎo)PMNs凋亡,甚至壞死,使得細(xì)胞活力減低,形態(tài)改變。同時(shí),對(duì)不同種屬來(lái)源的PMNs,顯示出不同的殺傷作用。(3)rPVL能促進(jìn)PMNs細(xì)胞因子IL-6、IL-8及TNF-α的表達(dá),同時(shí),可上調(diào)PMNs TLR2、TLR4表達(dá),提示rPVL可通過(guò)TLR信號(hào)傳導(dǎo)通路,促進(jìn)NF-κB活化,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

【引證文獻(xiàn)】

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1 張翠萍;P-V殺白細(xì)胞素相關(guān)肺損傷的炎癥機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：1347904