本文關(guān)鍵詞：曲古抑菌素A（TSA）在IFN-γ調(diào)控TRIM22表達中的作用及其機制研究　出處：《復旦大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關(guān)文章： 曲古 抑菌 IFN- 調(diào)控 TRIM22 表達 中的 作用 及其 機制 研究

【摘要】：TRIM22 (Tripartite Motif 22)是TRIM蛋白家族成員之一。TRIM家族蛋白結(jié)構(gòu)保守,與機體的多種生理功能有關(guān),如細胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡等。近年來研究發(fā)現(xiàn)多種TRIM家族蛋白在抗病毒固有免疫中發(fā)揮重要作用,其中研究最為深入的是TRIM5α。TRIM5a具有廣泛的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒作用,是恒河猴抵抗人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的關(guān)鍵分子。值得關(guān)注的是,多種TRIM家族分子亦是干擾素(interferon,IFN)誘導基因,如TRIM5α、TRIM19、TRIM21、TRIM22、TRIM25和TRIM34等,它們在IFN介導的抗病毒固有免疫中起到重要作用,提示TRIM家族蛋白是一類新型抗病毒固有免疫分子。 在正常生理條件下,TRIM22主要表達在外周血單個核細胞和淋巴組織,如胸腺和脾臟中,可能與造血細胞的分化有關(guān)。在受到IFN、脂多糖(LPS)及p53等因素刺激下,TRIM22可在多種組織細胞中顯著上調(diào)表達。本課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)TRIM22,而非TRIM5a,是肝細胞中被干擾素誘導表達最強的TRIM分子之一,并能有效抑制乙型肝炎病毒(HBV)的復制。急性HBV感染猩猩的肝基因組學研究亦發(fā)現(xiàn),TRIM22與IFN以非細胞裂解方式清除HBV的過程相關(guān)。另有研究表明TRIM22,而非TRIM5a,參與干擾素的抗HIV作用,將TRIM22基因knockdown后,干擾素將不能有效抑制HIV的復制。這些研究結(jié)果均提示TRIM22是干擾素抗病毒過程中的關(guān)鍵效應分子�；诖�,本課題組的前期工作對IFN-γ轉(zhuǎn)錄調(diào)控TRIM22的分子機制進行了研究。我們鑒定出一個在干擾素對TRIM22轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到關(guān)鍵作用的順式作用元件——5’延伸的干擾素刺激反應元件(5'extended IFN-stimulating response element,5'elSRE),并發(fā)現(xiàn)干擾素調(diào)節(jié)因子(IFN regulatory factor, IRF)-1能與該反應元件結(jié)合,從而在IFN-y誘導TRIM22表達的過程中起到重要作用。 組蛋白去乙�；�(Histone deacetylases. HDACs)在真核細胞基因的表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用,HDACs通常被認為與真核細胞基因轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。但新近研究發(fā)現(xiàn)HDACs對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控比預想的要復雜得多：(1)HDACs亦可作為轉(zhuǎn)錄活化子來發(fā)揮功能；(2)除組蛋白外,HDACs亦可調(diào)控非組蛋白(如轉(zhuǎn)錄因子)的乙�；剑�(3)HDACs亦在蛋白的泛素化修飾中起重要作用。尤為有趣的是,有研究發(fā)現(xiàn)HDACs抑制劑(如TSA)在IFN對某些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用,但其機制仍不明確。 大量研究表明,組蛋白乙酰化程度的降低與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。HDACs抑制劑(如TSA、NaB和VPA等)因可上調(diào)腫瘤細胞中組蛋白乙酰化水平、恢復正常的基因表達譜,從而在抗腫瘤治療中備受關(guān)注。但人們在應用HDACs抑制劑治療腫瘤的過程中發(fā)現(xiàn),HDACs抑制劑處理可促進肝細胞中HCV和HBV的復制,這提示HDACs抑制劑可能影響某些具有重要抗病毒功能的干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs)的表達。因本課題組的前期研究表明TRIM22在抗HBV固有免疫應答中起重要作用,且是干擾素抗病毒的關(guān)鍵效應分子,我們設(shè)想HDACs抑制劑對病毒復制的促進作用可能由于其阻斷了IFN-γ對TRIM22的誘導表達所導致。為此,本課題將研究HDACs抑制劑對IFN-γ誘導TRIM22表達的影響,并在此基礎(chǔ)上進一步探討其作用機制,以期為基于TRIM22的抗病毒策略提供新的理論依據(jù)。 第一部分TSA抑制IFN-γ對TRIM22的誘導表達 前期的研究結(jié)果表明,TRIM22在肝細胞中的基礎(chǔ)表達值低,但可被IFN-γ有效誘導表達。為研究HDACs抑制劑在IFN-γ誘導TR1M22表達中的作用,我們首先檢測了一種常用的HDACs抑制劑——曲古抑菌素A (Trichostain A, TSA)對TRIM22誘導表達的影響。在TSA存在或不存在的情況下,利用IFN-γ刺激HepG2細胞,再通過實時定量PCR (qPCR)和Western blot技術(shù)分別檢測TRIM22 mRNA和蛋白水平的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA可在mRNA和蛋白水平上有效抑制IFN-γ對TRIM22的上調(diào)表達,并且這種抑制作用呈劑量和時效依賴性。為闡明TSA是在哪一層面影響了IFN-γ對TRIM22基因的誘導表達,我們在IFN-γ處理的HepG2細胞中加入轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D (AtcD)后,再行檢測TSA對TRIM22 mRNA的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSA并不影響IFN-γ誘導的TRIM22 mRNA的穩(wěn)定性,提示TSA在IFN-γ誘導TRIM22表達中的作用可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。為此,我們將TRIM22啟動子依賴的熒光素酶報告質(zhì)粒(pLuc-160)轉(zhuǎn)入HepG2細胞中,轉(zhuǎn)染24小時后,在TSA存在或不存在的情況下,用IFN-γ刺激HepG2細胞,隨后檢測轉(zhuǎn)染細胞裂解液中的熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA可有效抑制IFN-γ誘導的TRIM22啟動子活性,并且這種抑制作用亦具有劑量和時效依賴性,表明TSA是在轉(zhuǎn)錄水平上抑制IFN-γ對TRIM22的誘導表達。為檢測TSA的抑制效應是否是通過特異性抑制HDACs的活性,我們進一步檢測了另一種HDACs抑制劑——NaB對IFN-γ誘導的TRIM22轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA和NaB均可在HepG2細胞中上調(diào)組蛋白H4的乙�；�,表明這兩種抑制劑均可有效抑制HDACs的活性；重要的是,與TSA相類似,NaB亦可以劑量依賴的方式有效抑制IFN-γ誘導的TRIM22啟動子活性,表明是HDACs活性的抑制導致IFN-γ不能有效誘導TRIM22的轉(zhuǎn)錄。 第二部分TSA抑制IFN-γ對TRIM22誘導表達的分子機制 本課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)IRF-1通過與5'eISRE結(jié)合在IFN-γ誘導TRIM22的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因上述研究結(jié)果表明TSA在轉(zhuǎn)錄水平上抑制了IFN-γ對TRIM22的誘導表達,我們探究TSA是否可影響在TRIM22表達調(diào)控中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子IRF-1。在TSA存在或不存在的情況下,利用IFN-γ處理HepG2細胞6小時后,抽提核蛋白,然后通過基于ELISA的轉(zhuǎn)錄因子分析技術(shù)檢測細胞核提取物中的IRF-1蛋白與5'eISRE的結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA處理組IRF-1與5'eISRE結(jié)合作用被顯著抑制。Western blot結(jié)果亦表明TSA處理可導致核內(nèi)IRF-I蛋白表達量顯著降低。而后我們檢測TSA處理不同時間后(0.5、1、2、6、12、24小時)IFN-γ誘導的IRF-1蛋白的表達情況,結(jié)果顯示TSA在各個時間點均可明顯抑制IFN-γ對IRF-1蛋白的誘導表達。為研究TSA對IRF-1蛋白水平的影響是否是因為TSA影響了IRF-1的轉(zhuǎn)錄,我們通過qPCR檢測了TSA對IRF-1 mRNA水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA并不顯著影響IFN-γ對IRF-1mRNA的誘導表達。已知STAT1在IFN-γ對IRF-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起關(guān)鍵作用,因而我們檢測了TSA對STAT1磷酸化的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSA處理組與未處理組在IFN-γ誘導STAT1磷酸化水平上無明顯差別。這些結(jié)果表明TSA并不明顯影響IRF-1的轉(zhuǎn)錄。隨后,我們檢測了TSA對IRF-1蛋白穩(wěn)定性的影響,發(fā)現(xiàn)在TSA存在的情況下,IFN-γ誘導的IRF-1蛋白的穩(wěn)定性下降,即TSA處理導致IRF-1蛋白降解加快。進一步研究發(fā)現(xiàn)TSA亦可導致外源性轉(zhuǎn)入的IRF-1蛋白降解加快。 有研究表明IRF-1蛋白半衰期短,主要通過泛素—蛋白酶體途徑被降解,而亦有研究發(fā)現(xiàn),HDACs抑制劑可誘導某些蛋白的泛素化。因此,我們推測TSA可能通過增強IRF-1蛋白的泛素化水平,從而導致IRF-1蛋白的降解。利用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞后,再檢測TSA對IFN-γ誘導IRF-1蛋白的表達情況。結(jié)果顯示,MG132可以抑制TSA對于1RF-1蛋白的降解。同時,我們亦檢測了溶酶體抑制劑氯喹(Chloroguine)在TSA促進IRF-1蛋白降解中的作用,發(fā)現(xiàn)Chloroguine對這一過程并沒有影響。這些結(jié)果表明,TSA可能通過泛素—蛋白酶體途徑促進IRF-1蛋白的降解。為了進一步驗證這一結(jié)論,我們將IRF-1過表達質(zhì)粒pIRF-1-Myc與Ub-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細胞,而后用偶聯(lián)Myc抗體的protein A/G進行pull-down,隨后再用HA抗體進行Western blot檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA可明顯增強IRF-1蛋白的泛素化水平。 在生理條件下,TSA的靶基因HDAC1在體內(nèi)主要發(fā)揮組蛋白去乙�；δ堋５陙硌芯堪l(fā)現(xiàn),HDAC1亦可在某些蛋白的去泛素化過程中起到重要作用。通過親和素凝膠沉淀分析發(fā)現(xiàn)HDAC1與IRF-1均可結(jié)合到TRIM22啟動子區(qū)域的5'eISRE上,這為HDAC1發(fā)揮對IRF-1的去泛素化作用提供了空間基礎(chǔ)。進一步的研究發(fā)現(xiàn),過表達HDAC1可明顯降低IRF-1蛋白的泛素化水平。 綜上所述,本研究證實組蛋白去乙�；敢种苿㏕SA可通過泛素—蛋白酶體途徑降解IRF-1蛋白,從而在轉(zhuǎn)錄水平上抑制IFN-γ對TR1M22的誘導表達。這為闡明抗乙肝病毒固有免疫分子TRIM22的調(diào)控表達和作用機制提供了新的實驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R346

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李慶,賀靖東,高強;比較TSA和MH瓊脂培養(yǎng)基在鑒定嗜血桿菌中的作用[J];中華微生物學和免疫學雜志;2001年S1期

2 張桂英,鄧法文,田新;4種腫瘤標志物在肺癌診斷中的應用評價[J];臨床檢驗雜志;2001年03期

3 孟兵;蔡樹雄;李仕卓;;CT測定胸腰椎椎弓根進釘點與TSA及其在術(shù)中的應用[J];中國臨床解剖學雜志;2006年04期

4 陳永銨,謝文偉,楊澤年,利盛成,方祥,姚漢剛;椎弓根進釘點間距及最佳內(nèi)傾進釘角的CT測量及其在術(shù)中的應用[J];中國臨床解剖學雜志;2002年04期

5 楊澤年,羅仲堯,陳永銨;螺旋CT對椎弓根螺釘固定術(shù)各種數(shù)據(jù)的測量應用[J];影像診斷與介入放射學;2003年02期

6 祝繼華,邱大為,夏吉榮,陳怡婷;TSGF與組合癌譜聯(lián)合檢測在惡性腫瘤中的診斷價值[J];重慶醫(yī)科大學學報;2004年02期

7 段志堅;高波;徐薇;周倩;熊思東;;人TRIM22基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和表達及TRIM22對Jurkat T細胞增殖的影響[J];現(xiàn)代免疫學;2008年04期

8 胡光勝;石巍;廖愛軍;曹文濤;曾斌;廖丹;;姜黃素和TSA對胃癌c-myc表達影響[J];醫(yī)學研究雜志;2010年05期

9 李英慧;李春義;陳芳杰;趙彥艷;;曲古抑菌素A對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞NOS1基因轉(zhuǎn)錄的影響[J];中國醫(yī)科大學學報;2010年11期

10 田曉予;余娟娟;米建強;王愛紅;劉華;;曲古霉素A對宮頸癌HeLa細胞的毒性及放射增敏作用[J];腫瘤防治研究;2011年10期

相關(guān)會議論文 前10條

1 寧淑芳;李青洋;梁明明;楊小淦;陸陽清;盧晟盛;盧克煥;;5-Aza-dc和TSA處理巴馬小型豬體細胞對其表觀遺傳修飾和核移植效果的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學分會第十五屆學術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2010年

2 楊正龍;方大綱;;復像分析中TSA算法的二維擴展[A];2001年全國微波毫米波會議論文集[C];2001年

3 胡林林;秦小娥;盧晟盛;陸陽清;盧克煥;;5-Aza-dc和TSA對陸川豬體細胞核移植的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學分會第十五屆學術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2010年

4 許慶豐;葉素珍;陳小強;;槽線天線設(shè)計及波束展寬方法[A];2009年全國天線年會論文集（上）[C];2009年

5 楊聯(lián)安;石小華;;土壤速效鉀養(yǎng)分含量的空間插值方法研究[A];中國測繪學會第八次全國會員代表大會暨2005年綜合性學術(shù)年會論文集[C];2005年

6 李家亓;李英慧;趙彥艷;;乙�；瘜DAH2基因表達的調(diào)控[A];中國的遺傳學研究——遺傳學進步推動中國西部經(jīng)濟與社會發(fā)展——2011年中國遺傳學會大會論文摘要匯編[C];2011年

7 杜明;袁佃帥;梁瑩;王亮;曾艷;朱士恩;;小鼠卵母細胞體外成熟過程中乙�；潭壬邔β亚饠U展的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學分會第十五屆學術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2010年

8 Sun Ho Kim;Cheol Ryong Ku;Eui Hyun Kim;Eun Jig Lee;;Surgical Outcome of Transsphenoidal Microsurgery in 200 Growth Hormone Secreting Pituitary Tumors : According to Shift of Surgical Paradigm[A];中國抗癌協(xié)會神經(jīng)腫瘤專業(yè)委員會第八屆學術(shù)會議論文集[C];2011年

9 陳雯;郭麗麗;周婷婷;王階;;丹參總酚酸對離體心臟缺血再灌注損傷的保護作用[A];2010年中國藥學大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

10 周浪漫;;兩例關(guān)于機車上螺桿式空氣壓縮機因潤滑不良引發(fā)的故障分析[A];鄭州鐵路局“十百千”人才培育助推工程論文集[C];2011年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 李鵬;TSA漲價趕早不趕晚[N];國際商報;2009年

2 本報記者 洪繼東;首批TSA培訓學員“上崗”[N];成都日報;2008年

3 本報記者 張鈺梅;馬士基為何重返TSA？[N];國際商報;2009年

4 研;TSA宣布明年5月調(diào)高指導運價[N];國際經(jīng)貿(mào)消息;2000年

5 汪沁;貨漲船高[N];國際經(jīng)貿(mào)消息;2002年

6 王守仁;印度托運人擬投訴TSA[N];國際商報;2010年

7 隨風;如何平衡安全與隱私？[N];中國民航報;2011年

8 劉靖紅;能順利實現(xiàn)嗎？[N];國際經(jīng)貿(mào)消息;2000年

9 王那;FMC加緊調(diào)查TSA[N];國際經(jīng)貿(mào)消息;2002年

10 于一;TSA不收港口擁擠附加費[N];國際經(jīng)貿(mào)消息;2002年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 孟瑾;組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A抑制結(jié)腸癌細胞生長作用機制研究[D];第四軍醫(yī)大學;2012年

2 謝詠秋;TSA在腦缺血再灌注損傷中的腦保護機制[D];中南大學;2011年

3 于玲;TSA調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激干預大鼠心肌缺血再灌注損傷及其機制研究[D];吉林大學;2013年

4 賀民;曲古抑素A（TSA）預處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的腦保護作用及機制研究[D];中南大學;2011年

5 劉鐵成;AZA和TSA對乳腺癌性激素受體基因表達調(diào)控的研究[D];蘇州大學;2011年

6 顧紅軍;組蛋白去乙�；�1在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用[D];第二軍醫(yī)大學;2009年

7 高波;固有免疫分子TRIM22對乙型肝炎病毒的抑制作用及其機制研究[D];復旦大學;2008年

8 田寶磊;PML及PML-NBs調(diào)控細胞凋亡機制的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2006年

9 李英慧;核因子（NF）-κB乙�；瘜ι窠�(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）基因表達的調(diào)控[D];中國醫(yī)科大學;2007年

10 王慶輝;骨髓來源的肥大細胞（BMMC）表面FcεRI表達調(diào)控及其生物學活性的研究[D];中國醫(yī)科大學;2010年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 王雅新;曲古抑菌素A（TSA）在IFN-γ調(diào)控TRIM22表達中的作用及其機制研究[D];復旦大學;2011年

2 李燁;知母皂苷（TSA）對實驗性腦缺血再灌注損傷動物模型的保護作用研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2010年

3 高璐;組蛋白去乙酰化酶抑制劑（TSA）對延邊黃牛體細胞克隆效率的影響[D];延邊大學;2011年

4 陳華華;TSA協(xié)同MG-132誘導淋巴瘤和骨髓瘤細胞凋亡及其機制的初步探討[D];第三軍醫(yī)大學;2010年

5 羅昶;TSA對人肝癌SMMC-7721細胞的增殖及CXCR4表達的影響[D];華中科技大學;2011年

6 薛小云;組蛋白去乙�；敢种苿┣乓志兀═SA）對骨肉瘤MG-63的誘導凋亡作用及其機制研究[D];山西醫(yī)科大學;2011年

7 國勝鐵;TSA下黑龍江省旅游業(yè)對就業(yè)貢獻的實證研究[D];黑龍江大學;2005年

8 龔雨琴;去乙�；敢种苿㏕SA通過激活ERK和p38抑制間充質(zhì)干細胞成脂分化[D];暨南大學;2012年

9 康雅雅;TSA和5-Aza-Cdr對豬孤雌激活胚胎發(fā)育及相關(guān)基因表達影響的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2013年

10 黃波;TSA濃度及處理時間對豬體細胞核移植胚胎體外發(fā)育及轉(zhuǎn)基因eGFP表達的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2010年

，

本文編號：1347903