本文關(guān)鍵詞：曲古抑菌素A（TSA）在IFN-γ調(diào)控TRIM22表達(dá)中的作用及其機(jī)制研究　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：TRIM22 (Tripartite Motif 22)是TRIM蛋白家族成員之一。TRIM家族蛋白結(jié)構(gòu)保守,與機(jī)體的多種生理功能有關(guān),如細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡等。近年來研究發(fā)現(xiàn)多種TRIM家族蛋白在抗病毒固有免疫中發(fā)揮重要作用,其中研究最為深入的是TRIM5α。TRIM5a具有廣泛的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒作用,是恒河猴抵抗人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的關(guān)鍵分子。值得關(guān)注的是,多種TRIM家族分子亦是干擾素(interferon,IFN)誘導(dǎo)基因,如TRIM5α、TRIM19、TRIM21、TRIM22、TRIM25和TRIM34等,它們在IFN介導(dǎo)的抗病毒固有免疫中起到重要作用,提示TRIM家族蛋白是一類新型抗病毒固有免疫分子。 在正常生理?xiàng)l件下,TRIM22主要表達(dá)在外周血單個核細(xì)胞和淋巴組織,如胸腺和脾臟中,可能與造血細(xì)胞的分化有關(guān)。在受到IFN、脂多糖(LPS)及p53等因素刺激下,TRIM22可在多種組織細(xì)胞中顯著上調(diào)表達(dá)。本課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)TRIM22,而非TRIM5a,是肝細(xì)胞中被干擾素誘導(dǎo)表達(dá)最強(qiáng)的TRIM分子之一,并能有效抑制乙型肝炎病毒(HBV)的復(fù)制。急性HBV感染猩猩的肝基因組學(xué)研究亦發(fā)現(xiàn),TRIM22與IFN以非細(xì)胞裂解方式清除HBV的過程相關(guān)。另有研究表明TRIM22,而非TRIM5a,參與干擾素的抗HIV作用,將TRIM22基因knockdown后,干擾素將不能有效抑制HIV的復(fù)制。這些研究結(jié)果均提示TRIM22是干擾素抗病毒過程中的關(guān)鍵效應(yīng)分子�；诖�,本課題組的前期工作對IFN-γ轉(zhuǎn)錄調(diào)控TRIM22的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。我們鑒定出一個在干擾素對TRIM22轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到關(guān)鍵作用的順式作用元件——5’延伸的干擾素刺激反應(yīng)元件(5'extended IFN-stimulating response element,5'elSRE),并發(fā)現(xiàn)干擾素調(diào)節(jié)因子(IFN regulatory factor, IRF)-1能與該反應(yīng)元件結(jié)合,從而在IFN-y誘導(dǎo)TRIM22表達(dá)的過程中起到重要作用。 組蛋白去乙�；�(Histone deacetylases. HDACs)在真核細(xì)胞基因的表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用,HDACs通常被認(rèn)為與真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。但新近研究發(fā)現(xiàn)HDACs對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控比預(yù)想的要復(fù)雜得多：(1)HDACs亦可作為轉(zhuǎn)錄活化子來發(fā)揮功能；(2)除組蛋白外,HDACs亦可調(diào)控非組蛋白(如轉(zhuǎn)錄因子)的乙�；剑�(3)HDACs亦在蛋白的泛素化修飾中起重要作用。尤為有趣的是,有研究發(fā)現(xiàn)HDACs抑制劑(如TSA)在IFN對某些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用,但其機(jī)制仍不明確。 大量研究表明,組蛋白乙�；潭鹊慕档团c腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。HDACs抑制劑(如TSA、NaB和VPA等)因可上調(diào)腫瘤細(xì)胞中組蛋白乙酰化水平、恢復(fù)正常的基因表達(dá)譜,從而在抗腫瘤治療中備受關(guān)注。但人們在應(yīng)用HDACs抑制劑治療腫瘤的過程中發(fā)現(xiàn),HDACs抑制劑處理可促進(jìn)肝細(xì)胞中HCV和HBV的復(fù)制,這提示HDACs抑制劑可能影響某些具有重要抗病毒功能的干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs)的表達(dá)。因本課題組的前期研究表明TRIM22在抗HBV固有免疫應(yīng)答中起重要作用,且是干擾素抗病毒的關(guān)鍵效應(yīng)分子,我們設(shè)想HDACs抑制劑對病毒復(fù)制的促進(jìn)作用可能由于其阻斷了IFN-γ對TRIM22的誘導(dǎo)表達(dá)所導(dǎo)致。為此,本課題將研究HDACs抑制劑對IFN-γ誘導(dǎo)TRIM22表達(dá)的影響,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討其作用機(jī)制,以期為基于TRIM22的抗病毒策略提供新的理論依據(jù)。 第一部分TSA抑制IFN-γ對TRIM22的誘導(dǎo)表達(dá) 前期的研究結(jié)果表明,TRIM22在肝細(xì)胞中的基礎(chǔ)表達(dá)值低,但可被IFN-γ有效誘導(dǎo)表達(dá)。為研究HDACs抑制劑在IFN-γ誘導(dǎo)TR1M22表達(dá)中的作用,我們首先檢測了一種常用的HDACs抑制劑——曲古抑菌素A (Trichostain A, TSA)對TRIM22誘導(dǎo)表達(dá)的影響。在TSA存在或不存在的情況下,利用IFN-γ刺激HepG2細(xì)胞,再通過實(shí)時定量PCR (qPCR)和Western blot技術(shù)分別檢測TRIM22 mRNA和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA可在mRNA和蛋白水平上有效抑制IFN-γ對TRIM22的上調(diào)表達(dá),并且這種抑制作用呈劑量和時效依賴性。為闡明TSA是在哪一層面影響了IFN-γ對TRIM22基因的誘導(dǎo)表達(dá),我們在IFN-γ處理的HepG2細(xì)胞中加入轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D (AtcD)后,再行檢測TSA對TRIM22 mRNA的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSA并不影響IFN-γ誘導(dǎo)的TRIM22 mRNA的穩(wěn)定性,提示TSA在IFN-γ誘導(dǎo)TRIM22表達(dá)中的作用可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。為此,我們將TRIM22啟動子依賴的熒光素酶報告質(zhì)粒(pLuc-160)轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染24小時后,在TSA存在或不存在的情況下,用IFN-γ刺激HepG2細(xì)胞,隨后檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中的熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA可有效抑制IFN-γ誘導(dǎo)的TRIM22啟動子活性,并且這種抑制作用亦具有劑量和時效依賴性,表明TSA是在轉(zhuǎn)錄水平上抑制IFN-γ對TRIM22的誘導(dǎo)表達(dá)。為檢測TSA的抑制效應(yīng)是否是通過特異性抑制HDACs的活性,我們進(jìn)一步檢測了另一種HDACs抑制劑——NaB對IFN-γ誘導(dǎo)的TRIM22轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA和NaB均可在HepG2細(xì)胞中上調(diào)組蛋白H4的乙�；�,表明這兩種抑制劑均可有效抑制HDACs的活性；重要的是,與TSA相類似,NaB亦可以劑量依賴的方式有效抑制IFN-γ誘導(dǎo)的TRIM22啟動子活性,表明是HDACs活性的抑制導(dǎo)致IFN-γ不能有效誘導(dǎo)TRIM22的轉(zhuǎn)錄。 第二部分TSA抑制IFN-γ對TRIM22誘導(dǎo)表達(dá)的分子機(jī)制 本課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)IRF-1通過與5'eISRE結(jié)合在IFN-γ誘導(dǎo)TRIM22的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因上述研究結(jié)果表明TSA在轉(zhuǎn)錄水平上抑制了IFN-γ對TRIM22的誘導(dǎo)表達(dá),我們探究TSA是否可影響在TRIM22表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子IRF-1。在TSA存在或不存在的情況下,利用IFN-γ處理HepG2細(xì)胞6小時后,抽提核蛋白,然后通過基于ELISA的轉(zhuǎn)錄因子分析技術(shù)檢測細(xì)胞核提取物中的IRF-1蛋白與5'eISRE的結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA處理組IRF-1與5'eISRE結(jié)合作用被顯著抑制。Western blot結(jié)果亦表明TSA處理可導(dǎo)致核內(nèi)IRF-I蛋白表達(dá)量顯著降低。而后我們檢測TSA處理不同時間后(0.5、1、2、6、12、24小時)IFN-γ誘導(dǎo)的IRF-1蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示TSA在各個時間點(diǎn)均可明顯抑制IFN-γ對IRF-1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。為研究TSA對IRF-1蛋白水平的影響是否是因?yàn)門SA影響了IRF-1的轉(zhuǎn)錄,我們通過qPCR檢測了TSA對IRF-1 mRNA水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA并不顯著影響IFN-γ對IRF-1mRNA的誘導(dǎo)表達(dá)。已知STAT1在IFN-γ對IRF-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起關(guān)鍵作用,因而我們檢測了TSA對STAT1磷酸化的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSA處理組與未處理組在IFN-γ誘導(dǎo)STAT1磷酸化水平上無明顯差別。這些結(jié)果表明TSA并不明顯影響IRF-1的轉(zhuǎn)錄。隨后,我們檢測了TSA對IRF-1蛋白穩(wěn)定性的影響,發(fā)現(xiàn)在TSA存在的情況下,IFN-γ誘導(dǎo)的IRF-1蛋白的穩(wěn)定性下降,即TSA處理導(dǎo)致IRF-1蛋白降解加快。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TSA亦可導(dǎo)致外源性轉(zhuǎn)入的IRF-1蛋白降解加快。 有研究表明IRF-1蛋白半衰期短,主要通過泛素—蛋白酶體途徑被降解,而亦有研究發(fā)現(xiàn),HDACs抑制劑可誘導(dǎo)某些蛋白的泛素化。因此,我們推測TSA可能通過增強(qiáng)IRF-1蛋白的泛素化水平,從而導(dǎo)致IRF-1蛋白的降解。利用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞后,再檢測TSA對IFN-γ誘導(dǎo)IRF-1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,MG132可以抑制TSA對于1RF-1蛋白的降解。同時,我們亦檢測了溶酶體抑制劑氯喹(Chloroguine)在TSA促進(jìn)IRF-1蛋白降解中的作用,發(fā)現(xiàn)Chloroguine對這一過程并沒有影響。這些結(jié)果表明,TSA可能通過泛素—蛋白酶體途徑促進(jìn)IRF-1蛋白的降解。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論,我們將IRF-1過表達(dá)質(zhì)粒pIRF-1-Myc與Ub-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,而后用偶聯(lián)Myc抗體的protein A/G進(jìn)行pull-down,隨后再用HA抗體進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA可明顯增強(qiáng)IRF-1蛋白的泛素化水平。 在生理?xiàng)l件下,TSA的靶基因HDAC1在體內(nèi)主要發(fā)揮組蛋白去乙�；δ堋５陙硌芯堪l(fā)現(xiàn),HDAC1亦可在某些蛋白的去泛素化過程中起到重要作用。通過親和素凝膠沉淀分析發(fā)現(xiàn)HDAC1與IRF-1均可結(jié)合到TRIM22啟動子區(qū)域的5'eISRE上,這為HDAC1發(fā)揮對IRF-1的去泛素化作用提供了空間基礎(chǔ)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)HDAC1可明顯降低IRF-1蛋白的泛素化水平。 綜上所述,本研究證實(shí)組蛋白去乙�；敢种苿㏕SA可通過泛素—蛋白酶體途徑降解IRF-1蛋白,從而在轉(zhuǎn)錄水平上抑制IFN-γ對TR1M22的誘導(dǎo)表達(dá)。這為闡明抗乙肝病毒固有免疫分子TRIM22的調(diào)控表達(dá)和作用機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R346

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本文編號：1347903