發(fā)布時間：2017-12-28 19:35

  本文關鍵詞：琥珀酰輔酶A轉移酶硝基化酪氨酸位點特異單克隆抗體的制備　出處：《湖南農業(yè)大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 3-硝基化酪氨酸 SCOT 單克隆抗體

【摘要】：硝基化是氧化應激條件下由活性氮物質引起的主要蛋白質翻譯后修飾之一,其中一種主要產物是3-硝基化酪氨酸(3NT)。肝外組織線粒體琥珀酰輔酶A轉移酶(SCOT)是一種重要的酮體代謝限速酶,通過LC-ESI-MS/MS分析,體外重組SCOT中的4位、76位酪氨酸殘基(Tyr4、Tyr76)被認為是過氧亞硝酸(ONOO-)的首要攻擊位點并且生成3NT。雖然SCOT酪氨酸硝基化修飾導致的蛋白質活性降低在糖尿病中已經被證實,但是由于SCOT蛋白質豐度以及離子化技術限制其體內硝基化位點無法通過質譜技術準確檢測,而開發(fā)特異性抗體則有可能方便將其檢測出來。 為了檢測糖尿病小鼠模型SCOT中酪氨酸硝基化位點,本實驗中,我們通過人工合成包含了硝基化Tyr4和Ty；76的肽段偶聯(lián)KLH作為抗原制備單克隆抗體,免疫Balb/c小鼠。脾細胞通過傳統(tǒng)PEG法與骨髓瘤細胞SP2/0融合制備雜交瘤細胞。通過克隆化,ELISA分步篩選過程,獲得和制備了4株單克隆抗體(CN-10、CN-11、CE-9、CE-14),能分別特異性結合各自硝基化抗原。分析表明四株抗體均是IgG1亞類,效價分別達到1：128000、1：32000、1：512000和1：4096000。通過Western blot和ELISA方法進一步對抗體特異性進行了驗證,四株抗體均能夠分別特異性識別SCOT中硝基化Tyr4、Tyr76位點同時和未硝基化SCOT, SCOT中其他3NT位點以及其他硝基化蛋白之間沒有交叉反應,其中CN-10、CE-9表現(xiàn)出更強的特異性。抗體為進一步研究生物體內酪氨酸硝基化修飾奠定了基礎。
[Abstract]:Nitration is one of the main protein post-translational modifications induced by reactive nitrogen substances under oxidative stress. One of the main products is 3- nitro tyrosine (3NT). Liver mitochondrial succinyl coenzyme A transferase (SCOT) is a kind of important ketone body metabolism, through LC-ESI-MS/MS analysis, the recombinant SCOT in vitro in 4 and 76 tyrosine residues (Tyr4, Tyr76) are considered peroxynitrous acid (ONOO-) of the primary attack sites and generate 3NT. Although lower SCOT tyrosine nitration causes protein activity in diabetes has been confirmed, but SCOT protein abundance and limit the in vivo ionization technique nitration sites cannot accurately detect by mass spectrometry, and the development of specific antibody will facilitate the detection.
【學位授予單位】：湖南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：1347186