本文關(guān)鍵詞：琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶硝基化酪氨酸位點(diǎn)特異單克隆抗體的制備　出處：《湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 3-硝基化酪氨酸 SCOT 單克隆抗體

【摘要】：硝基化是氧化應(yīng)激條件下由活性氮物質(zhì)引起的主要蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一,其中一種主要產(chǎn)物是3-硝基化酪氨酸(3NT)。肝外組織線粒體琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(SCOT)是一種重要的酮體代謝限速酶,通過(guò)LC-ESI-MS/MS分析,體外重組SCOT中的4位、76位酪氨酸殘基(Tyr4、Tyr76)被認(rèn)為是過(guò)氧亞硝酸(ONOO-)的首要攻擊位點(diǎn)并且生成3NT。雖然SCOT酪氨酸硝基化修飾導(dǎo)致的蛋白質(zhì)活性降低在糖尿病中已經(jīng)被證實(shí),但是由于SCOT蛋白質(zhì)豐度以及離子化技術(shù)限制其體內(nèi)硝基化位點(diǎn)無(wú)法通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)準(zhǔn)確檢測(cè),而開(kāi)發(fā)特異性抗體則有可能方便將其檢測(cè)出來(lái)。 為了檢測(cè)糖尿病小鼠模型SCOT中酪氨酸硝基化位點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)人工合成包含了硝基化Tyr4和Ty；76的肽段偶聯(lián)KLH作為抗原制備單克隆抗體,免疫Balb/c小鼠。脾細(xì)胞通過(guò)傳統(tǒng)PEG法與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合制備雜交瘤細(xì)胞。通過(guò)克隆化,ELISA分步篩選過(guò)程,獲得和制備了4株單克隆抗體(CN-10、CN-11、CE-9、CE-14),能分別特異性結(jié)合各自硝基化抗原。分析表明四株抗體均是IgG1亞類,效價(jià)分別達(dá)到1：128000、1：32000、1：512000和1：4096000。通過(guò)Western blot和ELISA方法進(jìn)一步對(duì)抗體特異性進(jìn)行了驗(yàn)證,四株抗體均能夠分別特異性識(shí)別SCOT中硝基化Tyr4、Tyr76位點(diǎn)同時(shí)和未硝基化SCOT, SCOT中其他3NT位點(diǎn)以及其他硝基化蛋白之間沒(méi)有交叉反應(yīng),其中CN-10、CE-9表現(xiàn)出更強(qiáng)的特異性。抗體為進(jìn)一步研究生物體內(nèi)酪氨酸硝基化修飾奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Nitration is one of the main protein post-translational modifications induced by reactive nitrogen substances under oxidative stress. One of the main products is 3- nitro tyrosine (3NT). Liver mitochondrial succinyl coenzyme A transferase (SCOT) is a kind of important ketone body metabolism, through LC-ESI-MS/MS analysis, the recombinant SCOT in vitro in 4 and 76 tyrosine residues (Tyr4, Tyr76) are considered peroxynitrous acid (ONOO-) of the primary attack sites and generate 3NT. Although lower SCOT tyrosine nitration causes protein activity in diabetes has been confirmed, but SCOT protein abundance and limit the in vivo ionization technique nitration sites cannot accurately detect by mass spectrometry, and the development of specific antibody will facilitate the detection.
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1347186