本文關(guān)鍵詞：大鼠SNP遺傳檢測技術(shù)研究　出處：《中國藥品生物制品檢定所》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,實(shí)驗(yàn)動物遺傳檢測方法不斷改進(jìn)和提高,從蛋白到基因組序列,從宏觀到微觀,以達(dá)到準(zhǔn)確、快速、高通量的檢測要求。目前,國內(nèi)外對近交系小鼠SNP遺傳檢測的研究較多,而對大鼠SNP遺傳標(biāo)記的研究較少,尤其是針對主要組織相容性復(fù)合體(RT1)上SNP遺傳標(biāo)記的研究尚未見報(bào)道。主要組織相容性復(fù)合體(RT1)是決定近交系大鼠免疫遺傳品質(zhì)最主要的基因群,也是進(jìn)行遺傳學(xué)檢測的一個重要研究領(lǐng)域。本論文以大鼠RT1復(fù)合物基因組中具有多態(tài)性的單個核苷酸(SNP)為研究對象,利用分子生物學(xué)技術(shù),建立了三種SNP遺傳檢測方法,為實(shí)驗(yàn)大鼠的遺傳質(zhì)量控制提供新的遺傳檢測手段。 本研究分為三個方面。第一部分是建立大鼠SNP直接測序分型遺傳檢測方法。通過比對NCBI Nucleiotide數(shù)據(jù)庫,查詢BN與F344近交系大鼠多態(tài)性程度高的區(qū)域即RT1區(qū)序列,選定多態(tài)性信息豐富的5個區(qū)域(A區(qū)、B區(qū)、C區(qū)、D區(qū)、E區(qū)),以國內(nèi)7種近交系大鼠(BN、F344、WKY、LEW、SHR、MIJ和HFJ)為模板進(jìn)行擴(kuò)增,目的片段經(jīng)直接測序后進(jìn)行序列比對,結(jié)果顯示共獲得10個SNP多態(tài)性位點(diǎn),即A區(qū)序列545位(A/G);B區(qū)序列279位(T/C)、548位(A/C);C區(qū)序列207位(C/T)、356位(T/C)、386位(C/T);D區(qū)序列192位(A/G);E區(qū)序列135位(C/T)、425位(A/G)、683位(A存在/缺失)。其中5個SNP位點(diǎn)已在NCBI SNP數(shù)據(jù)庫中公布且獲得RS號。3個區(qū)域(B區(qū)、C區(qū)、E區(qū))的多態(tài)性信息豐富,每300bp包含1個SNP位點(diǎn)。不同品系大鼠在這5個區(qū)域上擁有不同的基因型,由此建立SNP直接測序的遺傳檢測方法,能夠?qū)ΤＳ媒幌荡笫蠛托屡嘤废颠M(jìn)行鑒定。 第二部分是建立大鼠SNP熒光定量PCR遺傳檢測方法。在大鼠RT1區(qū)選擇9個有效的SNP位點(diǎn)(RS13458024、RS13457316、RS13456231、RS8159611、RS8149053、RS8156941、RS8166089、RS8160925、RS13448591),并設(shè)計(jì)相應(yīng)的Taqman MGB探針。制備每個SNP位點(diǎn)不同基因型的質(zhì)粒對照品,以驗(yàn)證探針的特異性。結(jié)果表明,2個Taqman MGB探針(RS13457316、RS8156941)熒光擴(kuò)增信號不強(qiáng)并無法準(zhǔn)確判定SNP位點(diǎn)的基因型,檢測效果較差;7個探針能夠準(zhǔn)確判定對照品的基因型,特異性強(qiáng)。使用這7個探針能夠鑒別國內(nèi)常用大鼠品系(BN、F344、WKY、LEW、SHR)和新培育品系(MIJ、HFJ)的基因型。實(shí)驗(yàn)中對于鑒別LEW/WKY、MIJ/HFJ這種親緣關(guān)系較近的品系,仍需要在研究中擴(kuò)大檢測的SNP位點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行區(qū)分。 第三部分是建立高保真酶特異性SNP遺傳檢測方法。在單管雙向等位基因特異性PCR中引入高保真酶的校正機(jī)制和硫代磷酸化修飾引物的抗外切酶作用,建立高保真酶特異性SNP檢測方法。在RT1區(qū)177個SNP位點(diǎn)中選擇多態(tài)性信息含量豐富的12個SNP為遺傳檢測位點(diǎn)(RS13458024、RS13457316、RS13456231、RS8159611、RS8149053、RS8156941、RS8166089、RS8160925、RS13448591、RS13451966、RS8158177、RS13458074),經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后得到9個SNP位點(diǎn)的高保真酶檢測體系。該體系能夠?qū)鴥?nèi)5種大鼠近交系(BN、F344、WKY、LEW、SHR)和2種新培育品系(MIJ和HFJ)進(jìn)行基因型檢測和品系間鑒定,其基因型結(jié)果均經(jīng)測序驗(yàn)證,證實(shí)方法的特異性和可靠性。其次,使用該方法對國內(nèi)培育的30只SD大鼠進(jìn)行遺傳檢測。在9個SNP位點(diǎn)上,其中4個位點(diǎn)在SD群體中完全純合,在RS13448591(A/G)、RS13458024(A/G)、RS13458074(T/C)、RS13457316(A/G)、RS13456231(T/C)這5個位點(diǎn)上出現(xiàn)雜合型,群體統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示,雜合子基因型頻率觀察值依次為0.1667,0.4333,0.4667,0.2667,0.1000,期望雜合度Nei(1973)依次為0.1528,0.4061,0.4444,0.2778,0.0950,遺傳多樣性Shannon指數(shù)(I)依次為0.2868,0.5961,0.6365,0.4506,0.1985,對這5個多態(tài)性位點(diǎn)的群體基因型進(jìn)行X2檢驗(yàn),顯示其P值均大于0.05,該群體符合Hardy-Weinberg平衡,樣本具有代表性。 本研究中,以SNP為遺傳標(biāo)記,分別使用直接測序技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)及高保真酶特異性檢測技術(shù),建立三種不同的SNP遺傳標(biāo)記的檢測體系,并把這些方法應(yīng)用于近交系大鼠常用品系和新培育品系的遺傳檢測中。還對封閉群大鼠的SNP位點(diǎn)的基因型進(jìn)行研究,對其基因頻率、基因型頻率及雜合性進(jìn)行了探討。這些研究不僅為近交大鼠品系間的鑒定提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),而且還為近交系和封閉群大鼠的遺傳檢測提供了新技術(shù)。本研究對提高我國實(shí)驗(yàn)動物遺傳檢測技術(shù)水平,促進(jìn)生命科學(xué)發(fā)展具有重要意義。
[Abstract]:In recent years, with the rapid development of molecular biology technology, the methods of genetic detection in laboratory animals have been improved and improved, from protein to genome sequence, from macroscopic to microscopic, so as to achieve accurate, fast and high-throughput detection requirements. At present, there are many studies on genetic detection of SNP in inbred mice at home and abroad, but few studies have been done on SNP genetic markers in rats. Especially for SNP, the SNP markers in the main histocompatibility complex (MHC) have not been reported yet. The major histocompatibility complex (RT1) is the most important gene group that determines the immune genetic quality of inbred line rats, and is also an important research area for genetic detection. In this paper, a single nucleotide (SNP) with polymorphisms in the genome of rat RT1 complex was selected as the research object. Three SNP genetic testing methods were established by molecular biology technology, which provided a new genetic detection method for the genetic quality control of experimental rats.
【學(xué)位授予單位】：中國藥品生物制品檢定所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【引證文獻(xiàn)】

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1 申幸嬌;岳秉飛;;分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在兔遺傳多樣性分析中的應(yīng)用[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2012年09期

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本文編號：1346505