本文關(guān)鍵詞：工程化的人抗人IgE抗體的制備　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：重組人IgE C3-C4抗原,獲得其特異性的高親和力工程化的人抗體及人源化的鼠單克隆抗體。 方法：用PCR的方法獲得人IgE C3-C4基因,與原核表達(dá)載體pET-19b連接得到表達(dá)質(zhì)粒并在大腸桿菌BL21(DE3) star pLysS中大量表達(dá)并純化。構(gòu)建人免疫球蛋白G基因文庫,并用重組的IgE C3-C4抗原借助克隆印記法對基因文庫進(jìn)行篩選以獲得特異性的高親和力抗體,然后用ELISA、Western blotting、Biacore及組胺釋放抑制試驗(yàn)等方法檢測其反應(yīng)性,并對抗體進(jìn)行鏈替換和點(diǎn)突變以尋求更高的親和力；同時(shí)用重組的IgE C3-C4抗原免疫BALB/c小鼠,將其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞,通過小鼠腹腔注射的方法從腹水中獲得大量鼠單克隆抗體,檢測其反應(yīng)性并初步進(jìn)行鼠單克隆抗體的人源化。 結(jié)果：成功制備了反應(yīng)性好的重組人IgE C3-C4抗原,成功構(gòu)建了非依賴性克隆滴度為9×107的人免疫球蛋白G基因文庫；用克隆印記法從所構(gòu)建的基因文庫中篩選到一個(gè)特異性的抗IgE C3-C4的抗體,體外試驗(yàn)檢測其反應(yīng)性好；獲得了一個(gè)鏈替換和三個(gè)點(diǎn)突變抗體,反應(yīng)性與原始抗體相當(dāng)；獲得了5株對重組IgE C3-C4抗原特異性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株,對其中2株分泌的單克隆抗體進(jìn)行初步人源化。 結(jié)論：利用重組的人IgE C3-C4抗原從人免疫球蛋白G基因文庫中篩選到一個(gè)特異性抗體,反應(yīng)性好；用雜交瘤的方法獲得的鼠單克隆抗體反應(yīng)性亦很好,均可進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)外試驗(yàn)以開發(fā)其應(yīng)用價(jià)值。 目的：溶組織內(nèi)阿米巴感染在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家中都會(huì)引起比較嚴(yán)重的疾病,為了對我國溶組織內(nèi)阿米巴的感染的血清流行病學(xué)情況有大致了解,特進(jìn)行此次調(diào)查。 方法：提取溶組織內(nèi)阿米巴HK9株滋養(yǎng)體的粗抗原；構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-19b-Igl-C,并在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中對Igl-C(溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體表面半乳糖／乙酰氨基半乳糖可抑制性凝集素中間亞單位的C末端,可用于血清學(xué)診斷)進(jìn)行大量表達(dá)并純化；隨后使用這兩種抗原,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對總共1312份血清樣本進(jìn)行檢測,最后再根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)建立logistic回歸模型,起到總結(jié)和預(yù)測發(fā)病概率的作用。 結(jié)果：提取了溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體粗抗原并大量表達(dá)了Igl-C蛋白,使用這兩種蛋白進(jìn)行了ELISA檢測。共檢測1312份血清(男：678,女：634),各省基于Igl-C檢測的感染率為：北京：1.06%(2/188),上海：3.85%(5/130),四川：7.04%(10/142),廣西：3.17%(6/189),貴州：14.39%(41/285),青海：0.53%(1/190),新疆：9.04%(17/188)。根據(jù)此結(jié)果得出logistic回歸模型： 結(jié)論：本調(diào)查是我國第一次關(guān)于溶組織內(nèi)阿米巴在健康人群中的感染情況的血清流行病學(xué)調(diào)查,其結(jié)果與1988-1992年的第一次全國人體寄生蟲病分布情況調(diào)查的結(jié)果一致；所得的logistic回歸模型與數(shù)據(jù)貼合,并能根據(jù)血清樣本的基本資料(性別、年齡、地域等)進(jìn)行驗(yàn)前概率的推測。 目的：對無經(jīng)驗(yàn)的工作人員來說,僅從形態(tài)學(xué)鑒定螨類十分困難,本研究旨在使用一種簡便易行的方法來鑒別常見無氣門螨類。 方法：先對螨類進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定以確定其種類,然后用CTAB裂解法抽取其基因組DNA;隨后用PCR的方法擴(kuò)增其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)和細(xì)胞色素氧化酶亞單位I(COI)基因,與測序載體連接后進(jìn)行測序。經(jīng)測序后先用ClustalX軟件進(jìn)行序列對齊,再用PHYLIP軟件計(jì)算遺傳距離,構(gòu)建鄰近型系統(tǒng)發(fā)生樹,并用PAUP軟件構(gòu)建最大簡約型系統(tǒng)發(fā)生樹。 結(jié)果：成功獲得了6種螨(橢圓食粉螨Aleuroglyphus ovatus,熱帶無爪螨Blomia tropicalis,粉塵螨Dermatophagoides farina,戶塵螨Dermatophagoides pteronyssinus,埋內(nèi)歐塵螨Euroglyphus maynei,腐食酪螨Tyrophagus putrescentiae)的ITS2基因,長度從316bp到488bp不等,基于ITS2計(jì)算所得各種螨種內(nèi)遺傳距離為0.00-0.077844,種間遺傳距離為0.202426-0.912959；成功獲得5種螨(橢圓食粉螨Aleuroglyphus ovatus,熱帶無爪螨Blomia tropicalis,粉塵螨Dermatophagoides farina,戶塵螨Dermatophagoides pteronyssinus,腐食酪螨Tyrophagus putrescentiae)的COI基因,長度為377bp或378bp,基于COI計(jì)算所得種內(nèi)遺傳距離為0.000--0.029748,種間遺傳距離為0.138403-0.279304；利用ITS2和COI基因構(gòu)建了分子進(jìn)化樹,可起到種類鑒別的作用。 結(jié)論：在形態(tài)鑒別困難的情況下,ITS2基因和COI基因可作為分子標(biāo)記用于鑒別無氣門螨類。
[Abstract]:Objective: to restructure human IgE C3-C4 antigen and obtain its specific high affinity engineered human antibody and humanized mouse monoclonal antibody.
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1346077