本文關鍵詞：機械拉伸誘導人骨髓間充質干細胞向肌腱細胞定向分化及其力信號轉導的實驗研究　出處：《重慶大學》2011年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：機體組織/細胞處于復雜的力學微環(huán)境中,且其生長發(fā)育受到力學微環(huán)境的調(diào)控。肌腱/韌帶組織是一種典型的傳遞肌肉收縮所產(chǎn)生的應力的連接性組織。它們在發(fā)育進程中,長期受到周期性牽拉產(chǎn)生的張應力,這對它們的形成具有重要的調(diào)節(jié)作用。然而,肌腱/韌帶由于過度負載或者老化引起的損傷在日常生活中很常見,而且其預防和治療仍是臨床醫(yī)生面臨的挑戰(zhàn)問題之一。 骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)是一種具有多向分化潛能的成體干細胞,由于其具有來源豐富、取材簡單、快速增殖、易于轉染外源基因、以及低免疫抗原反應等優(yōu)點,成為組織工程、基因治療以及細胞治療的研究熱點。目前已經(jīng)有研究報道機械刺激可以誘導BM-MSCs向肌腱細胞方向分化。這為利用組織工程實現(xiàn)肌腱/韌帶損傷修復帶來了新希望,但是其力信號轉導和分子機理還不清楚,并成為后續(xù)研究工作的重點。 為了進一步研究機械刺激對BM-MSCs向肌腱細胞方向分化的影響以及分化過程中的相關力信號轉導。本文以人骨髓間充質干細胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hMSCs)為研究對象,利用拉伸裝置(ST-140)對hMSCs加載一定的機械拉伸,通過實時定量PCR檢測肌腱相關標記基因的表達情況,篩選誘導hMSCs向肌腱細胞方向分化的機械拉伸條件;并且利用Y-27632、細胞松弛素D和PF 530228 (PF 228)分別抑制RhoA/ROCK、細胞骨架和FAK(Focal adhesion kinase, FAK),考察RhoA/ROCK、細胞骨架和FAK在機械拉伸誘導hMSCs向肌腱細胞方向分化過程中的作用。 本文得到的主要實驗結果如下: ①hMSCs多向分化潛能 多向分化潛能通常是指在體外誘導條件下具有分化為成骨細胞、成脂肪細胞和軟骨細胞的能力。我們利用成骨誘導分化培養(yǎng)基、成脂肪誘導分化培養(yǎng)基和成軟骨誘導分化培養(yǎng)基誘導hMSCs,以MSCs基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照。誘導21天后分別進行茜素紅、油紅O和阿爾新藍組織化學染色。染色結果顯示成骨誘導分化培養(yǎng)基誘導21天后,誘導組茜素紅染色呈陽性而對照組呈陰性;成脂肪誘導分化培養(yǎng)基誘導21天后,誘導組油紅O染色呈陽性而對照組呈陰性;成軟骨誘導分化培養(yǎng)基誘導21天后,誘導組阿爾新藍染色呈陽性而對照組呈陰性。這表明:我們的研究對象hMSCs,在體外具有分化為成骨細胞、成脂肪細胞和軟骨細胞的多向分化能力。 ②機械拉伸誘導hMSCs向肌腱細胞方向分化 對hMSCs加載不同條件的機械拉伸(頻率:0.1 Hz、1.0 Hz,應變大小:5%、10%、15% strain,拉伸時間:24 h、48 h),通過實時定量RT-PCR和Western blot技術分別檢測肌腱相關標記基因如Collagen type I (Col I)、Collagen type III(Col III)、tenascin-C(TNC)和scleraxis(SCX),和肌腱相關標記蛋白如Col I和TNC的表達。實驗結果顯示:不同的機械拉伸引起的基因和蛋白的表達變化不盡相同。在本研究范圍內(nèi),1.0 Hz、10% strain,持續(xù)時間分別為24 h和48 h能夠促進肌腱相關標記基因和蛋白的表達。加載機械拉伸24 h后,Col I、Col III、TNC和SCX的基因表達分別為相應對照組的1.220±0.057倍、1.31±0.087倍、1.355±0.133倍和1.605±0.244倍;Col I和TNC的蛋白表達分別為1.191±0.042倍和1.47±0.047倍。加載機械拉伸48 h后,Col I、Col III、TNC和SCX的基因表達分別為1.285±0.049倍、1.375±0.152倍、1.64±0.146倍和2.503±0.285倍;Col I和TNC的蛋白表達分別為1.258±0.093倍和2.231±0.278倍。這些實驗結果表明1.0 Hz、10% strain,持續(xù)時間48 h的機械拉伸能夠誘導hMSCs向肌腱細胞方向分化。同時我們觀察到機械拉伸誘導hMSCs垂直于拉伸方向排列,而且細胞排列的趨勢和拉伸頻率、拉伸形變和拉伸時間相關。 ③Y-27632、細胞松弛素D和PF 228對機械拉伸誘導的actin超微結構的變化的影響 以Fluoresceinisothiocyanate (FITC)-phalloidin標記細胞骨架F-actin,通過激光共聚焦顯微鏡觀察actin的超微結構。利用Y-27632、細胞松弛素D和PF 228分別抑制RhoA/ROCK、細胞骨架和FAK,考察RhoA/ROCK、細胞骨架和FAK對機械拉伸誘導的hMSCs形態(tài)和actin超微結構的變化的影響。激光共聚焦顯微鏡的實驗結果顯示:靜態(tài)培養(yǎng)的細胞隨機排列,actin沿著細胞長軸呈隨機排列;機械拉伸促進actin的聚合,使actin的密度升高,并誘導actin纖維垂直于拉伸方向排列。Y-27632處理的細胞,actin的聚合受到抑制,只有少數(shù)actin分布在細胞邊緣;Y-27632處理的細胞加載機械拉伸后,actin呈隨機排列,密度沒有顯著變化,但是actin變得不連續(xù)并呈點狀,細胞邊緣出現(xiàn)很短的actin。細胞松弛素D處理的細胞,actin變短且不連續(xù),并在細胞邊緣聚積;細胞松弛素D處理的細胞加載機械拉伸后,actin的不連續(xù)和點狀程度更加明顯,且actin呈隨機排列。PF 228處理的細胞,actin并無顯著變化;PF 228處理的細胞加載機械拉伸后,actin出現(xiàn)撕裂狀,部分actin不再沿著細胞長軸排列,而是垂直于拉伸方向排列,而且拉伸后產(chǎn)生一些細胞碎片。這些結果表明RhoA/ROCK和FAK對機械拉伸誘導的actin的變化至關重要,而且機械拉伸通過誘導actin垂直于拉伸方向排列,最終引起細胞垂直于拉伸方向排列。 ④Y-27632、細胞松弛素D和PF 228抑制機械拉伸誘導的FAK 397位點Tyr磷酸化及向肌腱細胞方向分化 Y-27632、細胞松弛素D和PF 228抑制機械拉伸誘導的hMSCs FAK磷酸化。Western blot結果顯示Y-27632和細胞松弛素D抑制后,FAK磷酸化下降到對照組水平; PF 228處理抑制機械拉伸誘導的FAK磷酸化,將FAK磷酸化水平下降到20%左右,且磷酸化程度比對照水平更低。這表明RhoA/ROCK和細胞骨架對機械拉伸誘導的FAK磷酸化具有重要的調(diào)節(jié)作用,而PF 228作為FAK的選擇性抑制劑對FAK磷酸化的抑制程度更劇烈。不僅如此,實驗結果進一步顯示:Y-27632、細胞松弛素D或PF 228處理,顯著抑制機械拉伸誘導的肌腱相關標記基因(Col I、Col III、TNC、SCX、EphA4、Eya2和Six1)和蛋白(Col I、Col III和TNC)的表達。相比而言,PF 228的抑制效果更加劇烈。這表明RhoA/ROCK、細胞骨架和FAK調(diào)節(jié)機械拉伸誘導的hMSCs向肌腱細胞方向分化。在這個分化過程中,RhoA/ROCK、細胞骨架和FAK之間相互影響、相互調(diào)節(jié),組成一個力學感應的信號網(wǎng)絡。這個信號網(wǎng)絡感應胞外力學環(huán)境,并將力信號轉變?yōu)樯盘?并進一步觸發(fā)向肌腱細胞方向分化進程。抑制這個信號網(wǎng)絡中的任何一個成員,將導致機械拉伸誘導hMSCs向肌腱細胞方向分化的失敗。綜合以上研究表明:hMSCs不僅具有分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞的能力,而且在機械拉伸加載條件(1.0 Hz,10% strain)的條件下,能夠向肌腱細胞方向分化。在機械拉伸誘導hMSCs向肌腱細胞方向分化過程中,激活的RhoA/ROCK、完整的細胞骨架和FAK Tyr397位點磷酸化是必要條件,而且RhoA/ROCK、細胞骨架和FAK相互影響并協(xié)同調(diào)節(jié)械拉伸誘導hMSCs向肌腱細胞方向分化。本研究對認識機械拉伸誘導hMSCs定向分化的分子基礎以及分化過程中力信號傳導具有重要意義,還可為臨床上腱/韌帶創(chuàng)傷的治療及其組織工程化提供定量的參考依據(jù)。
[Abstract]:The tissue / cell of the body is in a complex mechanical microenvironment, and its growth and development are regulated by the mechanical microenvironment. Tendon / ligament tissue is a typical connective tissue that transfers the stress produced by muscle contraction. During their development, they have long been produced by the periodic traction of Zhang Yingli, which plays an important role in the formation of them. However, injuries caused by overload or aging of tendons and ligaments are very common in daily life, and prevention and treatment is still a challenge for clinicians.
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【引證文獻】

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1 孫文才;李玉成;李博;姜鑫;李曉龍;陳永春;白玉江;;豬小腸黏膜下層作為組織工程肌腱支架的強度[J];中國組織工程研究;2012年29期

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本文編號：1346090