發(fā)布時間：2017-12-28 05:16

  本文關(guān)鍵詞：人乳牙牙髓干細(xì)胞與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨能力的比較研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景和目的 干細(xì)胞具有自我更新以及多向分化潛能,在組織器官的發(fā)育以及損傷的修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用,并且為再生醫(yī)學(xué)以及組織工程提供種子細(xì)胞。研究證實(shí)乳牙牙髓中含有多向分化能力的干細(xì)胞即乳牙牙髓干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED),在體外環(huán)境作用下可以向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等方向進(jìn)行分化,乳牙牙髓干細(xì)胞作為一種新發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞在組織工程學(xué)中具有非常光明的應(yīng)用前景。已有的克隆篩選干細(xì)胞的方法程序復(fù)雜,周期較長,我們希望應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)在體外分離乳牙牙髓干細(xì)胞,進(jìn)一步擴(kuò)增培養(yǎng),研究乳牙牙髓干細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物的表達(dá)以及多向分化能力等,以期建立一種便捷有效的分離方法并明確乳牙牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性,并對其成骨能力與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞作比較,為乳牙牙髓干細(xì)胞更好的應(yīng)用到組織工程學(xué)中提供有價值的信息。 2003年SHED由Miura等首次報道以來便成為研究的熱點(diǎn),SHED作為一種新發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞,在胚胎發(fā)育方面與頜面部骨組織具有相同的來源,應(yīng)用SHED來修復(fù)頜面部骨缺損也許更為合適,SHED在取材過程中基本沒有痛苦,更為人們所接受,并且臍帶血庫的成功建立應(yīng)用,為我們提供了一個很好的榜樣或許我們可以同樣建立SHED庫以備不時只需(在日本、香港、新加坡等國家和地區(qū)已有乳牙牙髓干細(xì)胞庫的成立)。早在1976年Friedenstein就證實(shí)骨髓當(dāng)中含有可以向骨、軟骨以及脂肪細(xì)胞分化的細(xì)胞。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)是骨髓中一類來源于中胚層的具有自我增殖和多向分化潛能的干細(xì)胞,在不同的誘導(dǎo)條件下可以向骨、脂肪、神經(jīng)、軟骨、心肌、骨骼肌等多方向分化,本研究對SHED的成骨能力與BMMSCs作對比以便為選擇合適的種子細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 人乳牙牙髓干細(xì)胞與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨能力的比較研究 一、方法 1 SHED與BMMSCs的收集培養(yǎng) 1.1乳牙牙髓細(xì)胞的收集和培養(yǎng) 依據(jù)Miura等的實(shí)驗(yàn)方法選取6～10歲健康兒童的滯留乳牙,采用酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞。將拔出的牙髓組織通過消化、過濾后得到細(xì)胞懸液,然后鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。 1.2磁珠篩選乳牙牙髓干細(xì)胞 取生長狀態(tài)良好的第3代乳牙牙髓細(xì)胞,按磁珠試劑盒要求以STRO-1為標(biāo)記物進(jìn)行篩選。 1.3骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的收集培養(yǎng) 骨髓收集自健康成年志愿者均已知情同意,年齡26-28歲,骨髓取自髂后上嵴,BMMSCs的收集分離篩選采用全骨髓法。 2 SHED與BMMSCs的生長曲線的測定 分別取乳牙牙髓細(xì)胞、BMMSCs以及通過篩選獲得的SHED制備單細(xì)胞懸液,MTT法測各孔OD值,連續(xù)測10天,以時間為橫軸、每天的平均OD值為縱軸繪制生長曲線。 3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記 取分選之后狀態(tài)良好的兩類干細(xì)胞分別檢測間質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記物CD29、CD105以及造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記物CD34、CD45的表達(dá)情況。 4體外多向誘導(dǎo)分化 兩類干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3周后,分別對其做ALP染色以及茜素紅染色；成脂誘導(dǎo)至3周后,對其做油紅O染色；成軟骨誘導(dǎo)4周后,做免疫細(xì)胞化學(xué)染色,檢測干細(xì)胞的多向分化能力。 5鈣黃綠素法礦鹽沉積熒光染色 兩類干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)并在在成骨誘導(dǎo)液中添加1μg/ml的鈣黃綠素連續(xù)培養(yǎng)21 d熒光顯微鏡下觀察礦鹽沉積變化。 6熒光定量PCR技術(shù)檢測成骨細(xì)胞基因表達(dá)水平 分別于成骨誘導(dǎo)后7d、14d、21d,用實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測成骨基因堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨橋蛋白(osteopontin, OPN)骨鈣素(osteocalcin, OC)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。 7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,P0.05表示差異有顯著意義。統(tǒng)計分析方法：整體比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,同一時間點(diǎn)不同組別的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,若方差不齊則用Satterthwaite近似t檢驗(yàn)。 二、結(jié)果 1細(xì)胞形態(tài)及生長情況 篩選的兩類干細(xì)胞形態(tài)相似,大部分細(xì)胞呈長梭形,SHED較BMMSCs體積略小,一周之后細(xì)胞可達(dá)85%融合,細(xì)胞呈魚群樣,形態(tài)大小相似。 2生長曲線的測定 三類細(xì)胞的生長曲線均成“S”型,但是乳牙牙髓細(xì)胞的生長速度比其他兩類干細(xì)胞的生長速度快,這符合干細(xì)胞慢周期的特點(diǎn)。 3兩類干細(xì)胞的間質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD29、CD105分別高表達(dá),造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34、CD45低表達(dá)。 4多向分化能力的檢測 向成脂誘導(dǎo)3周后,油紅O染色兩類干細(xì)胞,鏡下可見細(xì)胞內(nèi)有大量的紅色脂滴；成骨方面誘導(dǎo)3周后兩類干細(xì)胞分別制作細(xì)胞爬片,堿性磷酸酶染色可以看見呈藍(lán)紫色的陽性表現(xiàn),茜素紅染色可見呈紅色陽性表現(xiàn)；成軟骨方向誘導(dǎo)四周之后,免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性。 5鈣黃綠素法檢測鈣鹽的沉積 誘導(dǎo)至21d時,細(xì)胞間隙中可見呈團(tuán)簇狀分布的礦鹽沉積；其中SHED組呈現(xiàn)大量團(tuán)簇狀分布的鈣鹽沉積,較BMMSCs組增多。 6熒光定量PCR技術(shù)檢測成骨基因的表達(dá) 分別于7d、14d、21d,檢測ALP、OPN以及OC三個成骨基因的表達(dá)水平,統(tǒng)計學(xué)處理提示,在同一時間點(diǎn)兩類干細(xì)胞的兩個成骨基因表達(dá)水平?jīng)]有差異,且隨著誘導(dǎo)時間的延長表達(dá)水平有相應(yīng)的變化。 三、結(jié)論 免疫磁珠法可以用來篩選乳牙牙髓細(xì)胞,獲得的SHED具有干細(xì)胞的特性,高表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記,低表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記物,并且具有向成骨、成脂、成軟骨等方向分化的能力,是一種快速可靠的分選方法。 SHED與BMMSCs在向成骨誘導(dǎo)一定時間之后在熒光顯微鏡下可見SHED鈣鹽沉積較BMMSCs更多,通過檢測不同時間點(diǎn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平可以看到,同一個基因隨著誘導(dǎo)時間的延長其表達(dá)水平也有相應(yīng)的變化；在同一個時間點(diǎn)相同的基因SHED與BMMSCs表達(dá)水平相同說明兩類干細(xì)胞具有相似的成骨能力。
[Abstract]:Background and purpose
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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1 別利克孜·卡德爾;劉奕杉;王璇;李伯琦;馬艷;畢曉娟;努斯來提·哈里克;;改良酶消化法分離培養(yǎng)人乳牙牙髓干細(xì)胞[J];中國組織工程研究;2013年10期

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本文編號：1344712