本文關(guān)鍵詞：雪卡毒素單克隆抗體的制備及鑒定　出處：《廣東工業(yè)大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：雪卡毒素是一種來源于岡比爾盤藻并通過食物鏈在珊瑚魚體內(nèi)富集的毒素。全世界每年約50000人遭受雪卡毒素中毒的困擾,因而建立一種快速有效的檢測方法成為科學(xué)家共同關(guān)注的課題。本論文利用雪卡毒素結(jié)構(gòu)類似物莫能菌素為半抗原,合成雪卡毒素人工抗原并免疫小鼠,制備雜交瘤誘導(dǎo)腹水并獲得高效價(jià)高特異性的單克隆抗體,建立雪卡毒素的免疫分析方法。 分別采用混合酸酐法和碳二亞胺法(EDC)將莫能菌素半抗原與牛血清白蛋白(BSA)和雞血清蛋白(OVA)偶聯(lián),合成莫能菌素人工免疫抗原和包被抗原。以免疫抗原免疫Balb/c小鼠3次后測定血清抗體效價(jià)及特異性。取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合制備雜交瘤,依據(jù)效價(jià)和特異性高的原則篩選并進(jìn)行4次有限稀釋亞克隆篩選,建立穩(wěn)定的細(xì)胞株。通過體內(nèi)誘生腹水法大量制備單克隆抗體,收集腹水并采用辛酸硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化,SDS-PAGE和紫外分光光度法鑒定抗體純度和含量。建立雪卡毒素間接競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測方法,并鑒定雪卡毒素單克隆抗體的特異性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)經(jīng)TLC及SDS-PAGE鑒定成功合成了雪卡毒素的人工免疫抗原及包被抗原,其中莫能菌素分子與BSA和OVA的偶聯(lián)比分別為18.5：1和7：1。(2)獲得3株穩(wěn)定分泌抗雪卡毒素抗體的雜交瘤細(xì)胞株1D5、2G11、3G11,且3株細(xì)胞分泌的抗體均屬于IgG1亞型,輕鏈為K鏈。(3)腹水抗體純化后經(jīng)SDS-PAGE鑒定有兩條帶,一條為重鏈,約55KD,另一條為輕鏈,約28KD。獲得較純的腹水單抗,其蛋白含量約為4.127mg/mL。(4)建立的雪卡毒素間接競爭ELISA條件為：包被抗原5μg/mL,37℃包被2h；3%脫脂奶粉封閉1h；一抗稀釋倍數(shù)1：6400；甲醇濃度10%；板外競爭；二抗工作濃度1：10000；顯色15min。(5)建立的雪卡毒素間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=10.722x+25.399,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9939,最低檢測限為0.12ng/mL。檢測范圍為0.12ng/mL～15.6ng/mL。(6)特異性實(shí)驗(yàn)測定了雪卡毒素單抗與其結(jié)構(gòu)類似物莫能菌素、海南霉素、馬杜霉素的交叉反應(yīng),結(jié)果表明制備的抗體與海南霉素及馬杜霉素的交叉反應(yīng)率均小0.01%,與莫能菌素的交叉反應(yīng)率較高。 結(jié)論：本研究制備的雪卡毒素單克隆抗體,特異性相對較高,為雪卡毒素免疫分析方法的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Ciguatoxin originates from the Gangbier gonium and through the food chain bioaccumulation of toxins in coral reef fish. The world each year about 50000 people suffer from ciguatoxin poisoning problems, thus to establish a fast and effective detection method has become the focus of the research scientists. This paper uses ciguatoxin analogues of monensin for synthesis of hapten, artificial antigen of ciguatoxin and immunized mice monoclonal antibody hybridoma induced ascites and obtain high titer specific immunity, establishment of ciguatoxin analysis method.
【學(xué)位授予單位】：廣東工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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2 李月明;雙酚A單克隆抗體制備及膠體金免疫層析試紙條的研制[D];廣東工業(yè)大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：1344711