本文關(guān)鍵詞：人類γδT細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性配體分子人MutS同源蛋白2的識(shí)別機(jī)制及相關(guān)天然免疫監(jiān)視作用研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 人MutS同源蛋白2 內(nèi)源性配體 γδT細(xì)胞 腫瘤免疫 感染免疫

【摘要】：人類γδT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中的一個(gè)特殊群體,在機(jī)體抗腫瘤及抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。然而,由于已發(fā)現(xiàn)和鑒定出的抗原(或配體)數(shù)量有限,且缺乏相應(yīng)的反應(yīng)性亞克隆T細(xì)胞抗原識(shí)別受體(T cell receptor, TCR)的結(jié)構(gòu)信息,γδT細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞之間相互作用的分子機(jī)制尚有待于進(jìn)一步闡明。 人類MutS同源蛋白2(Human MutS homologue 2, hMSH2)是DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白家族的一個(gè)重要成員,通常定位于細(xì)胞核并與hMSH3或hMSH6形成異源二聚體,參與修復(fù)DNA合成中的堿基錯(cuò)配,以保證基因組的忠實(shí)性。遺傳性或獲得性的hMSH2缺陷與諸多癌癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。在前期的研究工作中,本實(shí)驗(yàn)室采用基于TCR互補(bǔ)決定區(qū)36鏈(Complementary determining region 3δchain, CDR3δ)肽結(jié)合特性的免疫親和篩選技術(shù)策略,用OT3肽探針從卵巢癌細(xì)胞系SKOV3的細(xì)胞提取物中釣取了三個(gè)可能被Vδ2 TCR識(shí)別的配體,hMSH2是其中之一。初步的研究結(jié)果表明,hMSH2在SKOV3的細(xì)胞表面有異位表達(dá),γδT細(xì)胞對(duì)SKOV3細(xì)胞的殺傷作用亦可為抗hMSH2抗體(Antibody, Ab)部分封閉。鑒于此,我們推測(cè)hMSH2是一個(gè)能為γδT細(xì)胞所識(shí)別的、腫瘤相關(guān)的內(nèi)源性抗原(或配體)分子。本研究旨在對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證,并進(jìn)一步探討γδT細(xì)胞識(shí)別hMSH2的分子機(jī)制及hMSH2在γ6 T細(xì)胞介導(dǎo)的天然免疫監(jiān)視應(yīng)答中的作用和意義。 本文的第一項(xiàng)研究?jī)?nèi)容旨在探索hMSH2的膜異位表達(dá)在上皮腫瘤細(xì)胞中是否具有普遍意義。針對(duì)此問(wèn)題,分析了宮頸癌、胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌及卵巢癌腫瘤細(xì)胞系HeLa、803、NCI-H520、HR8348、SKOV3、HO8910及ES-2細(xì)胞中hMSH2的基因序列、mRNA水平及蛋白質(zhì)表達(dá)情況,并對(duì)這五種腫瘤病人癌組織標(biāo)本中hMSH2的分布進(jìn)行了分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,hMSH2在受測(cè)的七種上皮腫瘤細(xì)胞表面均存在異位表達(dá)(陽(yáng)性率14.2～68.2%),而在正常對(duì)照細(xì)胞HK-2、成纖維細(xì)胞及γδT細(xì)胞表面則幾乎沒(méi)有表達(dá)(陽(yáng)性率2.2%),提示hMSH2的膜異位表達(dá)在上皮腫瘤細(xì)胞中可能具有普遍意義。激光共聚焦掃描顯微鏡術(shù)和免疫組織化學(xué)染色分析的結(jié)果也顯示,hMSH2在上皮腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)異常的亞細(xì)胞分布,表現(xiàn)為廣泛的胞膜、胞質(zhì)異位表達(dá),胞核分布則多減弱或消失�；驕y(cè)序結(jié)果表明,hMSH2的基因序列在大多數(shù)上皮腫瘤細(xì)胞系中并無(wú)突變,其mRNA表達(dá)水平在不同上皮腫瘤細(xì)胞系間也存在較大差異。 hMSH2在上皮腫瘤細(xì)胞表面不尋常的異位表達(dá)為其作為γδT細(xì)胞識(shí)別的配體提供了可能。因此,本文的第二項(xiàng)研究?jī)?nèi)容重點(diǎn)驗(yàn)證了γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞膜異位表達(dá)的hMSH2的識(shí)別作用。首先,運(yùn)用抗體殺傷封閉實(shí)驗(yàn),在HeLa、803及NCI-H520細(xì)胞中初步證實(shí)了hMSH2的膜異位表達(dá)與γδT細(xì)胞對(duì)上皮腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用間存在聯(lián)系。其次,運(yùn)用小RNA干擾(Small interference RNA, siRNA)技術(shù)靶向沉默HeLa、803及NCI-H520細(xì)胞中hMSH2的表達(dá),并比較γδT細(xì)胞對(duì)干擾組及Mock組殺傷效率的差異。結(jié)果表明,異位表達(dá)的hMSH2的確能被γδT細(xì)胞識(shí)別,并參與γδT細(xì)胞對(duì)上皮細(xì)胞腫瘤的免疫監(jiān)視作用。隨后,通過(guò)殺傷實(shí)驗(yàn)及重組hMSH2 (Recombinant hMSH2, rhMSH2)體外刺激實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Vδ2 T細(xì)胞是hMSH2的主要反應(yīng)性γδT細(xì)胞亞群。最后,通過(guò)對(duì)HeLa、803及NCI-H520細(xì)胞膜蛋白的分離純化Western blot分析,鑒定出上皮腫瘤細(xì)胞膜異位表達(dá)的hMSH2為分子量(Molecular weight, MW)約105千道爾頓(Kilodalton, kDa)的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。 由于Vδ2 T細(xì)胞組成性地表達(dá)NKG2D受體,且有研究表明γδT細(xì)胞的某些配體分子如MHCⅠ類分子鏈相關(guān)抗原A和B(MHC classⅠ-related chains A and B, MICA/B)、UL16結(jié)合蛋白4(UL16-binding protein 4, ULBP4)等存在TCR及NKG2D雙重識(shí)別機(jī)制,本文的第三項(xiàng)研究?jī)?nèi)容著重探討了γδT細(xì)胞對(duì)hMSH2的識(shí)別是否同樣存在TCRγδ及NKG2D雙重途徑。首先,用抗體封閉與siRNA干擾相結(jié)合的方法,研究TCRγδ和/或NKG2D封閉是否能夠抑制膜異位表達(dá)hMSH2所介導(dǎo)的γδT細(xì)胞(或NK-92細(xì)胞)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別與殺傷作用；其次,將rhMSH2蛋白在體外與γδT細(xì)胞預(yù)孵育,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析rhMSH2對(duì)TCRγδ及NKG2D的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合作用；此外,運(yùn)用表面離子共振技術(shù)(Surface plasmon resonance, SPR)對(duì)NKG2D與rhMSH2的直接結(jié)合作用及親和力進(jìn)行了進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示,hMSH2介導(dǎo)的γδT細(xì)胞(或NK-92細(xì)胞)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別與殺傷能被anti-TCRγδ和/或anti-NKG2D Ab封閉所抑制；rhMSH2能競(jìng)爭(zhēng)性地與TCRγδ及NKG2D結(jié)合;NKG2D能直接與rhMSH2結(jié)合,Kd值為132 nM。這些結(jié)果說(shuō)明γδT細(xì)胞對(duì)hMSH2的識(shí)別存在TCRγδ及NKG2D雙重途徑。 γδT細(xì)胞在抗病毒感染免疫中發(fā)揮著重要作用。γδT細(xì)胞識(shí)別的某些內(nèi)源性抗原(或配體)分子,如熱休克蛋白(Heat shock protein, HSP) 90、HSP60及ULBPs等,在病毒感染細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。因此,本文的第四項(xiàng)研究?jī)?nèi)容通過(guò)建立Epstein-barr病毒(Epstein-barr virus, EBV)轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型,觀察hMSH2在EBV轉(zhuǎn)化類淋巴母細(xì)胞中的表達(dá)變化及這種變化對(duì)γδT細(xì)胞清除病毒感染細(xì)胞作用的影響,進(jìn)一步研究了hMSH2在γδT細(xì)胞介導(dǎo)的病毒感染免疫監(jiān)視中的作用。結(jié)果表明,EBV感染細(xì)胞hMSH2的轉(zhuǎn)錄水平及膜異位表達(dá)均明顯增高；膜異位表達(dá)的hMSH2亦介導(dǎo)了γδT細(xì)胞對(duì)EBV感染細(xì)胞的識(shí)別,并顯著增強(qiáng)了γδT細(xì)胞的靶向殺傷作用。這提示hMSH2可能如γδT細(xì)胞識(shí)別的大多數(shù)內(nèi)源性抗原(或配體)一樣具有應(yīng)激分子的特性,且在γδT細(xì)胞介導(dǎo)的抗EBV感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。 綜上所述,本文得出的主要結(jié)論如下：(1)hMSH2的膜異位表達(dá)在上皮腫瘤細(xì)胞中具有一定的普遍性；(2)異位表達(dá)的hMSH2能被γδT細(xì)胞的抗原識(shí)別受體TCRγδ和NKG2D雙重識(shí)別,并主要參與Vδ2 T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用；(3)上皮腫瘤細(xì)胞膜異位表達(dá)的hMSH2為MW約105 kDa的全長(zhǎng)蛋白；(4)hMSH2的異位表達(dá)能被EBV感染所誘導(dǎo),并顯著增強(qiáng)γδT細(xì)胞對(duì)病毒感染細(xì)胞的清除作用。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)體現(xiàn)在：一是初步驗(yàn)證了hMSH2的膜異位表達(dá)在上皮腫瘤細(xì)胞中具有一定的普遍性,提示hMSH2可能是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的上皮腫瘤標(biāo)志分子；二是首次證明hMSH2作為一個(gè)腫瘤相關(guān)的內(nèi)源性抗原分子,能通過(guò)TCRγδ及NKG2D雙重識(shí)別途徑被γδT細(xì)胞識(shí)別,為γδT細(xì)胞識(shí)別的抗原(或配體)譜增添了新的分子,揭示了γδT細(xì)胞識(shí)別、殺傷上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞的新的分子機(jī)制；三是首次報(bào)道了hMSH2分子在EBV感染細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá),并闡明了該分子在γδT細(xì)胞介導(dǎo)的抗EBV感染免疫中的作用,揭示了γδT細(xì)胞識(shí)別和清除EBV病毒感染細(xì)胞的新的分子機(jī)制,豐富了目前對(duì)γδT細(xì)胞在病毒感染免疫中重要作用的認(rèn)識(shí)。 總之,本文通過(guò)對(duì)上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞及EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞表面hMSH2的異位表達(dá)及γδT細(xì)胞對(duì)其識(shí)別機(jī)制的深入研究,進(jìn)一步揭示了γδT細(xì)胞免疫監(jiān)視的新型作用方式,為全面闡明γδT細(xì)胞的生物學(xué)功能提供了新的線索,亦為建立新的腫瘤及病毒感染免疫治療策略提供了可能的靶標(biāo)分子。
[Abstract]:Human gamma delta T cells are a special group of T lymphocytes, which play an important role in the anti-tumor and anti infection immune responses of the body. However, as has been found and identified the antigen (or ligand) quantity is limited, and the lack of appropriate reactive subclones of T cell antigen recognition receptor (T cell, receptor, TCR) the information structure, molecular mechanism of interaction between T cells and tumor cells or virus-infected cells still remains to be elucidated.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1342995