發(fā)布時(shí)間：2017-12-27 18:18

  本文關(guān)鍵詞：多因素干預(yù)促進(jìn)視神經(jīng)再生的實(shí)驗(yàn)研究及視神經(jīng)缺血模型的建立　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：青光眼、外傷性、缺血性視神經(jīng)病變、視神經(jīng)炎等是目前世界范圍內(nèi)的主要致盲性眼病,臨床上尚無根治這類疾病的方法,最根本的原因就在于視神經(jīng)軸突缺乏有效的再生能力,損傷后很難修復(fù)。如何有效的保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)元,促進(jìn)其軸突再生,維持并改善視功能,是目前眼科乃至神經(jīng)科學(xué)亟待解決的難題。本研究一方面在目前視神經(jīng)再生研究的基礎(chǔ)上,聯(lián)合拮抗多種抑制損傷軸突再生的內(nèi)在、外在因素,從而更有效的促進(jìn)了損傷軸突再生；另一方面,建立了新型大鼠后部缺血性視神經(jīng)病變的動(dòng)物模型,為深入研究該疾病奠定了基礎(chǔ)亦為視神經(jīng)再生的研究提供了新的且更符合生理損傷過程的視神經(jīng)病變模型。 第一部分聯(lián)合拮抗多種抑制軸突生長的內(nèi)在和外在因素促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突再生 目的：視神經(jīng)軸突損傷后再生能力受到眾多外在和內(nèi)在因素的共同調(diào)控。本研究旨在通過聯(lián)合干預(yù)多種抑制軸突生長的內(nèi)、外在因素,促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突再生。 方法：成年大鼠玻璃體腔注射多種AAV8Y733F-shRNA病毒下調(diào)RGCs內(nèi)KLF9、KLF13、KLF16、KLF2、KLF5、KLF15或PTEN的表達(dá)。AAV2-Cre玻璃體腔注射分別敲除PTENfl/fl小鼠、KLF4fl/fl小鼠以及PTENfl/flKLF4fl/fl小鼠RGCs內(nèi)PTEN和／或KLF4基因,并且通過玻璃體腔注射AAV2-C3抑制RGCs內(nèi)RhoA的活性,拮抗微環(huán)境中多種抑制損傷軸突再生的因子。熒光金上丘逆標(biāo)RGCs,視網(wǎng)膜鋪片計(jì)數(shù)比較視神經(jīng)損傷后各組RGCs存活率。熒光霍亂毒素B亞單位順行標(biāo)記再生軸突,視神經(jīng)縱行切片在損傷位點(diǎn)后不同距離計(jì)數(shù)再生軸突數(shù)量。 結(jié)果：與對(duì)照組相比,同時(shí)下調(diào)RGCs內(nèi)KLF2、KLF5和KLF15的表達(dá)后,能夠顯著提高RGCs的存活率達(dá)50%以上。KLF9、KLF13和KLF16同時(shí)下調(diào)組與PTEN下調(diào)組RGCs也顯示出了與KLF2、5、15下調(diào)組相似的保護(hù)作用,并且各組再生軸突數(shù)量亦較對(duì)照組顯著增多,但再生軸突大部分局限在距離挫傷位點(diǎn)1mm以內(nèi)。條件性敲除小鼠RGCs內(nèi)PTEN基因,能夠顯著促進(jìn)視神經(jīng)再生,而KLF4的條件性敲除卻對(duì)損傷視神經(jīng)軸突再生無明顯的促進(jìn)作用,且PTEN與KLF4雙基因敲除對(duì)軸突的促進(jìn)作用與PTEN單基因敲除相似。聯(lián)合應(yīng)用C3阻斷RhoA的活性后,各組軸突再生的數(shù)量和長度均有所增加,尤其以PTEN的敲除和C3聯(lián)合應(yīng)用組再生軸突的數(shù)量最多,并且最長的再生軸突能夠延伸到挫傷位點(diǎn)后4mm。 結(jié)論：聯(lián)合下調(diào)KLFs家族多種抑制RGCs軸突生長的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)視神經(jīng)損傷后RGCs有保護(hù)作用并且能在一定程度上促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突的再生。與KLF4發(fā)育性敲除不同,成年小鼠條件性敲除RGCs內(nèi)KLF4并不能促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突再生。而同時(shí)拮抗軸突再生的外在抑制因素(C3的應(yīng)用)和提高RGCs軸突自身的生長能力(PTEN的敲除)則能夠更有效的促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突的再生。 第二部分 新型大鼠后部缺血性視神經(jīng)病變模型的建立 目的：建立大鼠后部缺血性視神經(jīng)病變的動(dòng)物模型,并且觀察視網(wǎng)膜和視神經(jīng)在該動(dòng)物模型中的病理生理改變以及神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)視神經(jīng)缺血性病變后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用。 方法：通過光化學(xué)反應(yīng)誘導(dǎo)缺血性損傷(Photochemical-induced ischemia)建立大鼠后部缺血性視神經(jīng)病變的動(dòng)物模型。高分子量熒光右旋糖昔心臟灌注觀察視網(wǎng)膜、視神經(jīng)的血供情況。損傷后不同時(shí)點(diǎn)視神經(jīng)切片,HE染色觀察損傷部位病理改變,免疫組化染色觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞／巨噬細(xì)胞的活化情況。上丘逆標(biāo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察損傷后RGCs死亡的時(shí)間和空間分布,以及神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)RGCs的保護(hù)作用。 結(jié)果：視神經(jīng)缺血損傷后,損傷局部血管滲漏,組織水腫并最終導(dǎo)致軸突空泡樣變性。缺血灶局部星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失而病灶周邊部則表現(xiàn)為肥大。小膠質(zhì)細(xì)胞／巨噬細(xì)胞首先在損傷局部活化,隨后遷移到遠(yuǎn)端視神經(jīng)乃至視交叉部位。缺血損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞隨著時(shí)間的推移逐漸減少,在損傷后1周、2周和3周分別減少23%,50%和70%,并且不同品系大鼠RGCs減少的空間分布不同,或?yàn)槿W(wǎng)膜的廣泛減少或局限于上方視網(wǎng)膜,與軸突在網(wǎng)膜內(nèi)的空間分布不同有關(guān)。BDNF和CNTF的多次應(yīng)用能夠有效的保護(hù)RGCs,至損傷后3周,能提高RGCs存活率達(dá)40%以上。 結(jié)論：我們通過PCI方法成功建立了大鼠后部缺血性視神經(jīng)病變的動(dòng)物模型,此模型中視網(wǎng)膜及視神經(jīng)在缺血損傷后所表現(xiàn)出的病理生理改變與臨床PION病人的病變過程很相似。這一大鼠后部缺血性視神經(jīng)病變模型不僅為進(jìn)一步深入研究PION疾病乃至其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性疾病的發(fā)病機(jī)理、分子生物學(xué)改變及藥物干預(yù)奠定了基礎(chǔ)。而且其作為一種更符合生理損傷過程的視神經(jīng)病變模型,可以被進(jìn)一步優(yōu)化用于視神經(jīng)再生領(lǐng)域的研究。
[Abstract]:Glaucoma, traumatic, ischemic optic neuropathy and optic neuritis is a worldwide major blindness, clinical methods and there is no cure for this disease, the most fundamental reason lies in the lack of effective regeneration of optic nerve after injury, it is difficult to repair. How to effectively protect the retinal neurons, promote the regeneration of the axons, maintain and improve the visual function, is a difficult problem to be solved in the ophthalmology and neuroscience. On the one hand, based on the current research on optic nerve regeneration, combined with a variety of internal and external factors of antagonistic inhibition of axon regeneration after injury, so as to more effectively promote axon regeneration; on the other hand, the establishment of the animal model of rat posterior ischemic optic neuropathy, which provides a new and more consistent optic nerve injury is also the basic physiological process of optic nerve regeneration for the further study of the disease.
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R774.1;R-332

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1342662