本文關(guān)鍵詞：miR-34a抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和甲型減毒嵌合流感病毒誘導(dǎo)HIV-1廣譜中和抗體的分子機(jī)制研究　出處：《吉林大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)和艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)是嚴(yán)重威脅人類健康的兩大重要疾病。本研究介紹了microRNA (miRNA)在肝癌中的重要作用,揭示miR-34a在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的作用機(jī)制。同時(shí),為了研制新型的AIDS疫苗,本文也介紹了甲型減毒嵌合流感病毒誘導(dǎo)HIV-1廣譜中和抗體的分子機(jī)制。 1. miR-34a抑制肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移 肝癌是一種發(fā)病率、死亡率均較高的惡性腫瘤,它帶有預(yù)后不良和遠(yuǎn)端侵襲轉(zhuǎn)移的特征。雖然腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是病人高死亡率的主要原因,但是我們對(duì)它的分子機(jī)制研究還是有限的。對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面的研究揭示miRNA在這些過程中的重要作用,因?yàn)閙iRNA能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的各種關(guān)鍵基因。 miRNA是真核生物中一類長(zhǎng)度為17 25個(gè)核苷酸(nt)的參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的小分子非編碼RNA。在動(dòng)物細(xì)胞中,成熟的miRNA與蛋白質(zhì)一起組成RISC復(fù)合體并與它的靶基因mRNA的3′UTR結(jié)合,從而引起靶mRNA的降解或翻譯的抑制。miRNA能夠作為癌基因或抑癌基因在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增值和凋亡。一方面,致癌性miRNA在腫瘤中常常過表達(dá),比如miR-21,miR-10b,miR-373和miR-520c在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)后誘導(dǎo)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。另一方面,抑癌性miRNA在腫瘤中常常下調(diào)表達(dá),例如miR-126*,miR-335,miR146a和miR-29c在腫瘤細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)后導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。 研究證明,miR-34a是p53的一個(gè)直接轉(zhuǎn)錄靶,它在各種癌癥中經(jīng)常被刪除。miR-34a的下調(diào)表達(dá)可能是由于腫瘤細(xì)胞中p53的失活突變。例如,在成神經(jīng)細(xì)胞瘤中可以觀察到miR-34a的表達(dá)喪失,它可能是由于染色體1p36區(qū)域的缺失,此區(qū)域包括miR-34a。此外,在15種胰腺癌細(xì)胞中檢測(cè)miR-34a表達(dá),其中11種miR-34a的表達(dá)降低或檢測(cè)不到。在25例人結(jié)腸癌組織中,與癌旁組織相比其中有9例(36%)顯示miR-34a的表達(dá)下調(diào)。最近,miR-34a的靶基因已經(jīng)被證實(shí),它可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期關(guān)鍵基因或凋亡抑制因子誘導(dǎo)G1期阻滯,細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老,這些靶基因包括CDK4/6、cyclin E2 (CCNE2)、cyclin D1 (CCND1)、E2F3、Bcl-2和MYCN。有趣地是,miR-34a也直接抑制癌基因酪氨酸激酶受體c-Met的表達(dá)。c-Met是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF的受體,它具有自主磷酸化活性的功能。HGF刺激的c-Met激活作用引發(fā)它的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的分子磷酸化,比如ERK1/2,這個(gè)關(guān)鍵因子影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。的確,c-Met蛋白參與細(xì)胞的離散,侵襲和轉(zhuǎn)移。這些證據(jù)表明miR-34a也可能具有調(diào)節(jié)侵襲轉(zhuǎn)移的作用。在本論文中,我們證明在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系HepG2中,miR-34a可以通過靶向與侵襲相關(guān)的c-Met基因調(diào)節(jié)細(xì)胞的離散,侵襲和轉(zhuǎn)移。此外,我們也在肝癌組織中確定并討論了miR-34a和c-Met的表達(dá)水平和可能的生物學(xué)功能。 本論文的研究證明,miR-34a的重要作用是通過抑制c-Met癌基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的離散,侵襲和轉(zhuǎn)移。我們利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)25例肝細(xì)胞癌病人的癌組織和癌旁組織中的miR-34a表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比,miR-34a在19例肝癌組織(76%)中表達(dá)下調(diào),并且這與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。此外,在肝癌樣本中miR-34a的明顯下調(diào)與c-Met蛋白的表達(dá),兩者呈負(fù)相關(guān)。在肝癌細(xì)胞系HepG2中,miR-34a的過表達(dá)有力的抑制腫瘤細(xì)胞的離散,侵襲和轉(zhuǎn)移;它直接靶向c-Met癌基因并且同時(shí)減少c-Met的mRNA和蛋白表達(dá)水平;因此在c-Met信號(hào)途徑中,它也減少了c-Met誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化水平。 總之,我們的研究證明了miR-34a全新的生物學(xué)功能,它能在肝癌細(xì)胞系HepG2中抑制腫瘤的離散、轉(zhuǎn)移和侵襲。同時(shí)我們也揭示了在肝癌組織中miR-34a的下調(diào)表達(dá)與c-Met蛋白上調(diào)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。本論文涉及引入miR-34a的策略抑制c-Met蛋白表達(dá),干擾HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,這為肝癌及其它腫瘤的基因治療提供了理論基礎(chǔ)。 2.甲型減毒嵌合流感病毒誘導(dǎo)HIV-1廣譜的中和抗體 人類流感病毒是一種被人們關(guān)注的全球性的傳染疾病。因此選擇一種用來(lái)繁殖流感病毒的細(xì)胞系對(duì)于生產(chǎn)流感疫苗是非常必要的。Vero細(xì)胞已經(jīng)30多年被廣泛的用于人類疫苗生產(chǎn),它是唯一連續(xù)傳代的被權(quán)威機(jī)構(gòu)所接受的用來(lái)生產(chǎn)全病毒疫苗的細(xì)胞系。甲型和乙型流感病毒通過紅血球凝聚素(HA)蛋白與宿主細(xì)胞表面糖脂或糖蛋白上的唾液酸寡糖結(jié)合。人類流感病毒優(yōu)先結(jié)合α2,6-連接的唾液酸(NeuAcα2,6Gal),而禽流感病毒主要結(jié)合α2,3-連接的唾液酸(NeuAcα2,3Gal)。雖然Vero細(xì)胞表面存在NeuAcα2,6Gal,但是它的含量沒有人類氣管上皮細(xì)胞中的含量高,所以導(dǎo)致人類流感病毒不適合在Vero細(xì)胞中生長(zhǎng)。 在本研究中,我們穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞用人類2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(SIAT1)的cDNA,它的產(chǎn)物催化糖蛋白上的半乳糖α2,6-唾液酸化作用。Vero細(xì)胞被帶有SIAT1的cDNA和新霉素抗性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,并且被G418硫酸鹽篩選。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后,通過Western blot和免疫熒光顯微技術(shù)證明,在Vero-SIAT1細(xì)胞中過表達(dá)SIAT1基因。通過SNA和MAA染色方法表明,與親本的Vero細(xì)胞相比,Vero-SIAT1細(xì)胞分別表達(dá)7倍高量的NeuAcα2,6Gal和3倍低量的NeuAcα2,3Gal。此外,甲型流感病毒(H1N1和H3N2)和乙型流感病毒在Vero-SIAT1細(xì)胞中繁殖具有更高的病毒滴度。Vero-SIAT1細(xì)胞系不僅有利于繁殖人類流感病毒,而且也為提高甲型減毒流感病毒的產(chǎn)量提供細(xì)胞基質(zhì)。 人類免疫缺陷病毒- 1 (HIV-1)包膜蛋白gp41保守的膜近外側(cè)區(qū)(membrane-proximal external region, MPER)是兩個(gè)廣譜的中和抗體2F5和4E10的作用靶點(diǎn),2F5和4E10這兩個(gè)抗原表位對(duì)于艾滋病疫苗的設(shè)計(jì)起著至關(guān)重要的作用。本課題試圖使用甲型減毒嵌合(包括2F5/4E10抗原表位)流感病毒作為載體在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)抗體。減毒流感病毒具有以下一些優(yōu)點(diǎn):首先,它能通過鼻腔進(jìn)行免疫并產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng);其次,流感病毒表面具有更多的HA蛋白,增加了與BCR的相互接觸;最后,與HIV-1病毒膜融合類似,流感病毒在進(jìn)入細(xì)胞時(shí)也改變自身構(gòu)象完成此過程。 為了增強(qiáng)這些抗原表位的暴露和發(fā)展AIDS疫苗成分,本課題構(gòu)建了甲型減毒嵌合流感病毒載體庫(kù),即通過分子克隆的方法將HIV-1的MPER (NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK)、2F5 (ELDKWA)或4E10 (NWFNIT)抗原表位替換至甲型流感病毒HA的MPER (IDGVKLESMGVYQ)的對(duì)應(yīng)區(qū)域。在研究中,共構(gòu)建了17個(gè)嵌合流感病毒載體,其能夠在HEK293T+Vero細(xì)胞中包裝并產(chǎn)生有感染性子代病毒。選取其中2個(gè)包裝效率高的甲型減毒嵌合流感病毒,分別是Flu-HIV-MPER (含2F5和4E10抗原表位)和Flu-HIV-4E10-3 (含4E10抗原表位)作為疫苗。RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)證明Flu-HIV-MPER和Flu-HIV-4E10-3的減毒性和抗原表位。 用不同的甲型減毒嵌合流感病毒單獨(dú)免疫豚鼠或用含2F5/4E10分支肽初免-甲型減毒嵌合流感病毒加強(qiáng)免疫豚鼠,來(lái)考察誘導(dǎo)廣譜中和抗體的能力。ELISA檢測(cè)和中和抗體檢測(cè)結(jié)果顯示,Flu-HIV-MPER或Flu-HIV-4E10-3不同的甲型減毒嵌合流感病毒單獨(dú)免疫豚鼠后血清中可以產(chǎn)生針對(duì)2F5或4E10抗原表位的抗體,具有較高的結(jié)合抗體滴度,并且血清50%中和HIV-1的SF162(B)、SC19-15(BC)、11018(BC)和YN78-8(BC)假病毒的滴度范圍是107～132。此外,2F5/4E10分支肽初免-相應(yīng)的甲型減毒嵌合流感病毒加強(qiáng)免疫后,Western blot結(jié)果說(shuō)明豚鼠血清中產(chǎn)生了類似2F5或4E10抗原表位的抗體;ELISA檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明在豚鼠血清中誘導(dǎo)出了比較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。HIV-1中和抗體檢測(cè)結(jié)果表明,不同的分支肽可以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)B/BC亞型HIV-1假病毒的中和抗體,嵌合流感病毒可以加強(qiáng)中和抗體的能力,血清50%中和HIV-1的SF162(B)、SC19-15(BC)、11018(BC)和YN78-8(BC)假病毒的滴度范圍是90～350�？傊菊n題首次以甲型減毒嵌合流感病毒為免疫原免疫豚鼠誘導(dǎo)出廣譜的HIV-1中和抗體,雖然中和活性相對(duì)較弱,但為發(fā)展有效的AIDS疫苗提供了新的思路。
[Abstract]:Hepatocellular Carcinoma (HCC) and AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS) are the two major diseases that seriously threaten human health. This study introduced the important role of microRNA (miRNA) in liver cancer, and revealed the mechanism of miR-34a in the regulation of gene expression in the invasion and metastasis of liver cancer. At the same time, in order to develop a new AIDS vaccine, this paper also introduces the molecular mechanism of HIV-1 broad-spectrum neutralizing antibody induced by influenza A virus.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.11

【參考文獻(xiàn)】

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1 何春艷;陳則;吳書軍;唐麗麗;秦潔;;Vero細(xì)胞流感病毒的大規(guī)模培養(yǎng)和純化[J];中國(guó)生物工程雜志;2008年11期

2 陳碧華,謝倩,劉康達(dá);C-Met信號(hào)阻斷對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力的影響[J];中華肝臟病雜志;2003年08期

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本文編號(hào)：1342679