本文關(guān)鍵詞：人源S100A1和S100B全基因合成、表達、單抗制備及其活性分析　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2011年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：S100A1和S100B蛋白是低分子量鈣結(jié)合蛋白,均屬于S100蛋白家族。S100蛋白家族分子具有廣泛的生物學活性。其主要功能是作為鈣結(jié)合蛋白參與多種細胞內(nèi)的活性調(diào)節(jié),通過鈣離子信號轉(zhuǎn)導、影響激素分泌、抑制微管蛋白的組裝及抑制蛋白激酶C介導的磷酸化等途徑,在細胞增殖與分化、肌肉收縮、基因表達與分泌、以及細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。研究表明,S100基因或蛋白在很多疾病中表達異常,如阿希海默病、銀屑病、膽囊纖維化、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化、心肌病和癌癥等,而且與疾病的分期和預(yù)后密切相關(guān)。目前,S100蛋白家族在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。但已有研究提示,S100蛋白家族通過調(diào)節(jié)信號通路影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。S100蛋白家族成員在多種腫瘤組織中高表達,其抗體在腫瘤的診斷和治療中具有很重要的潛在作用和意義。 S100A1和S100B蛋白是最早被發(fā)現(xiàn)的S100蛋白家族成員。S100A1蛋白的表達有高度的組織特異性和細胞特異性,在骨骼肌中很少表達,而在健康心肌細胞中則大量表達。心力衰竭時S100A1表達下降,增加S100A1的表達能改善心肌細胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運的動態(tài)平衡,抑制心肌細胞凋亡,改善心肌能量供應(yīng),影響心臟重構(gòu),從而改善心肌收縮、舒張功能,抑制和逆轉(zhuǎn)心力衰竭的進展。S100A1可與其它S100家族成員如S100A4共同作用,影響腫瘤的浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外,它還參與細胞糖代謝,與細胞骨架動力學組成相關(guān),通過與G蛋白作用調(diào)控cAMP的信號傳導途徑,參與細胞增殖相關(guān)的鈣信號傳導過程。 S100B是S100家族中存在于腦內(nèi)最主要和最具有活性的成員,約96%存在于腦內(nèi),主要由星形膠質(zhì)細胞合成。S100B蛋白有廣泛的生物學活性,在生理情況下發(fā)揮重要的生理功能,但含量過高可能具有直接神經(jīng)毒性作用,或者同糖基化終末產(chǎn)物的受體(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)相互作用而導致神經(jīng)細胞凋亡。S100B能調(diào)節(jié)細胞的可塑性,有助于星形膠質(zhì)細胞的鈣處理能力,參與信息傳遞,調(diào)節(jié)細胞代謝,有膠質(zhì)源性的營養(yǎng)作用。此外, S100B能促進胰島細胞、垂體瘤細胞分泌胰島素和催乳素,參與炎癥反應(yīng)。神經(jīng)膠質(zhì)細胞旁分泌和自分泌S100B蛋白,可作用于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞,促進神經(jīng)的生長和損傷的修復(fù)。 S100A1和S100B蛋白與很多疾病的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系,在胞內(nèi)和胞外均能發(fā)揮其生物學作用。由于S100A1和S100B蛋白功能的多樣性,研究人員把S100A1和S100B蛋白作為某些疾病診斷的標志物以及潛在藥物靶標進行探索,并已取得了階段性研究成果。目前,對S100A1和S100B蛋白的功能研究比較全面,但開展S100A1和S100B蛋白作用機制方面的研究很少,S100A1和S100B蛋白在細胞內(nèi)外發(fā)揮作用的信號轉(zhuǎn)導途徑是什么?是否存在特異性受體?其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機制如何?需要進一步研究確定。但S100A1和S100B蛋白及其單克隆抗體多為進口產(chǎn)品,價格高,購買困難,無論從經(jīng)濟上還是效率上都限制了對該蛋白和抗體的研究和利用,不利于大規(guī)模地開展蛋白相關(guān)功能及其機制的研究。因此,我們擬構(gòu)建人源S100A1和S100B蛋白表達載體,制備高純度國產(chǎn)人源S100A1和S100B蛋白及其單克隆抗體。制備獲得的重組蛋白,可用于腫瘤組織的臨床檢測及分子靶標作用的基礎(chǔ)研究,以揭示其作用機制。制備其單克隆抗體可用于人源S100A1和人源S100B蛋白表達水平的檢測、疾病診斷、治療及預(yù)后判斷,這為以后深入研究該蛋白特性及其在相關(guān)疾病中的作用機制奠定了基礎(chǔ),具有重要的現(xiàn)實意義。主要研究結(jié)果如下:第一部分:人源S100A1和S100B全基因合成和優(yōu)化、表達、純化與鑒定 實驗一人源S100A1全基因合成和優(yōu)化、表達、純化與鑒定 方法: 1.優(yōu)化人源S100A1基因序列,設(shè)計合成人源S100A1序列引物,在兩端引物分別引入EcoR I和BamH I酶切位點,分段合成法PCR全基因合成人源S100A1全基因。 2.回收純化PCR產(chǎn)物, TA克隆至載體pMD18-T ,構(gòu)建克隆載體pMD18-S100A1,并將其轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α中,PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子,小量提取質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定后送invitrogen公司測序。 3.用EcoR I和BamH I雙酶切測序正確的pMD18-S100A1,與經(jīng)同樣酶切的pBV220質(zhì)粒用T4 DNA連接酶連接,構(gòu)建表達質(zhì)粒pBV220 -S100A1,并將其轉(zhuǎn)化到表達宿主E.coli DH5α中,PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子。 4.將陽性單菌接種于含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中,熱激誘導表達人源S100A1蛋白。 5. SDS-PAGE和Western Blotting分析鑒定重組蛋白。 6.采用離子交換層析法純化人源S100A1蛋白。 7.脫鹽并凍干人源S100A1蛋白。 結(jié)果: 1.全基因合成了人源S100A1基因,成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pBV220-S100A1,經(jīng)酶切鑒定和DNA序列測序分析表明,該質(zhì)粒含有人源S100A1基因的編碼序列全長,開放閱讀框架正確。 2.重組表達質(zhì)粒pBV220-S100A1轉(zhuǎn)化入表達宿主,誘導表達產(chǎn)物經(jīng)純化、SDS-PAGE和Western Blotting分析,表明表達蛋白為人源S100A1蛋白。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建含有人源S100A1編碼序列原核表達載體pBV220-S100A1。 2.經(jīng)熱激誘導表達、離子交換層析純化獲得純度達95%的重組S100A1蛋白。 實驗二人源S100B全基因合成和優(yōu)化、表達、純化與鑒定 方法: 1.優(yōu)化人源S100B基因序列,設(shè)計合成人源S100B序列引物,在兩端引物分別引入Nde I和XhoⅠ的酶切位點,分段合成法PCR合成人源S100B基因。 2.回收純化PCR產(chǎn)物,TA克隆至載體pMD18-T,構(gòu)建克隆載體pMD18-S100B,并將其轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α中,PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子,小量提取質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定后送invitrogen公司測序。 3.用Nde I和XhoⅠ雙酶切測序正確的pMD18-S100B,與經(jīng)同樣酶切的pET32a質(zhì)粒用T4 DNA連接酶連接,構(gòu)建表達質(zhì)粒pET32a-S100B,并將其轉(zhuǎn)化到表達宿主E.coli BL21(DE3)中,PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子。 4.將陽性單菌接種于含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中,IPTG誘導表達人源S100B蛋白。 5. SDS-PAGE和Western Blotting分析鑒定重組蛋白。 6.采用離子交換層析法純化人源S100B蛋白。 7.脫鹽并凍干人源S100B蛋白。 結(jié)果: 1.全基因合成人源S100B基因,成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET32a-S100B,經(jīng)酶切鑒定和DNA序列測序分析表明,該質(zhì)粒含有人源S100B基因的編碼序列全長,開放閱讀框架正確。 2.重組表達質(zhì)粒pET32a-S100B轉(zhuǎn)化入表達宿主,誘導表達產(chǎn)物經(jīng)純化、SDS-PAGE和Western Blotting分析,表明表達蛋白為人源S100B蛋白。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建含有人源S100B編碼序列原核表達載體pET32a-S100B。 2.經(jīng)IPTG誘導表達、離子交換層析純化獲得純度≥95%的重組S100B蛋白。 第二部分:人源S100A1和S100B蛋白促進Hela細胞侵襲遷移研究 方法: 利用人工基底膜和基質(zhì)膠,模擬在體的基質(zhì)膜屏障,根據(jù)腫瘤細胞穿過基質(zhì)膜的數(shù)量間接反映它的侵襲能力,而腫瘤細胞穿過不含基質(zhì)膠濾膜的數(shù)量間接反映它的遷移能力。鋪有基質(zhì)膠的濾膜放在上下室之間,鋪有基質(zhì)膠面朝向上室,在下室中加趨化劑,對照組上室加入100uL重懸的Hela細胞和100uL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,實驗組上室加入100uL重懸的Hela細胞和100uL重組蛋白,具有侵襲能力的細胞在趨化劑誘導下開始穿膜運動。穿過濾膜的細胞多數(shù)粘附在濾膜下表面,可用棉簽將上表面的細胞拭去,然后經(jīng)固定、染色,觀察統(tǒng)計穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)量。 結(jié)果: 1.人源S100A1蛋白顯著提高Hela細胞遷移能力(與對照組相比,P0.05),但對其侵襲能力無顯著影響。 2.人源S100B蛋白可使Hela細胞的侵襲能力提高2.8倍,遷移能力提高3.5倍。 結(jié)論: 1.純化獲得的重組人源S100A1蛋白具有生物活性,可提高腫瘤細胞的遷移能力。但對其侵襲能力影響較小。 2.純化獲得的重組人源S100B蛋白具有生物活性,可提高腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。 第三部分:抗人S100A1和S100B蛋白單克隆抗體的制備、純化與鑒定 實驗一抗人S100A1蛋白單克隆抗體的制備、純化與鑒定 方法: 1.將純化的重組人源S100A1蛋白和免疫佐劑共同制備成免疫原,免疫小鼠。 2.用傳統(tǒng)的細胞融合法,將免疫成功的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤細胞。 3. ELISA檢測雜交瘤細胞上清液中抗人S100A1抗體的效價,篩選陽性細胞株。 4.有限稀釋法對陽性細胞株進行亞克隆,得到能夠分泌目標抗體的單細胞株。 5.凍存陽性細胞株,三個月后復(fù)蘇細胞,檢測其抗體分泌的穩(wěn)定性。 6.體內(nèi)接種雜交瘤單細胞株,制備腹水型單克隆抗體,用Protein G HP層析純化蛋白,得到人源S100A1單克隆抗體。 7. Western Blotting及ELSIA法鑒定抗體特異性。 8. ELSIA法測定抗體的親和常數(shù)。 結(jié)果: 1.獲得了4株能穩(wěn)定分泌抗人S100A1單克隆抗體細胞株。 2. 4株細胞抗體親和常數(shù)均較高,結(jié)合抗原的能力均較強,與其他抗原無交叉反應(yīng),特異性好。 結(jié)論: 1.建立了能穩(wěn)定分泌抗人S100A1單克隆抗體的雜交瘤細胞株。 2.制備出抗人S100A1單克隆抗體,并進行了相關(guān)性質(zhì)鑒定。 實驗二抗人S100B蛋白單克隆抗體制備、純化與鑒定 方法: 1.將純化的重組人源S100B蛋白和免疫佐劑共同制備成免疫原,免疫小鼠。 2.用傳統(tǒng)的細胞融合法,將免疫成功的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤細胞。 3. ELISA檢測雜交瘤細胞上清液中人源S100B抗體的效價,篩選陽性細胞株。 4.有限稀釋法對陽性細胞株進行亞克隆,獲得能分泌目標抗體的單細胞株。 5.凍存陽性細胞株,三個月后復(fù)蘇細胞,檢測其抗體分泌的穩(wěn)定性。 6.體內(nèi)接種雜交瘤單細胞株,制備腹水型單克隆抗體,用Protein G HP純化蛋白,獲得人源S100B單克隆抗體。 7. Western Blotting及ELSIA法鑒定抗體特異性。 8. ELSIA法測定抗體的親和常數(shù)。 結(jié)果: 1.獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗人S100B單克隆抗體的細胞株。 2. 3株細胞抗體親和常數(shù)均較高,結(jié)合抗原的能力均較強,與其它抗原無交叉反應(yīng),特異性好。 結(jié)論: 1.建立了能穩(wěn)定分泌抗人S100B單克隆抗體的雜交瘤細胞株。 2.制備出抗人S100B單克隆抗體,并進行了相關(guān)特性鑒定。 第四部分:抗人S100A1和S100B單克隆抗體活性分析 方法: 1.外源性給予抗人S100A1單克隆抗體,觀察其對人黑色素瘤細胞A375增殖、凋亡及P53蛋白表達的影響。 2.以商業(yè)化的抗人S100A1單克隆抗體為對照,利用制備的抗人S100A1單克隆抗體Western Blotting法檢測人黑色素瘤細胞A375中S100A1蛋白的表達。 3.外源性給予抗人S100B單克隆抗體,觀察其對人黑色素瘤細胞A375增殖、凋亡及P53蛋白表達的影響。 4.商業(yè)化的抗人S100B單克隆抗體為對照,利用制備的抗人S100B單克隆抗體Western Blotting法檢測人黑色素瘤細胞A375中S100B蛋白的表達。 結(jié)果: 1.外源性給予抗人S100A1單克隆抗體,細胞增殖速度減慢,細胞凋亡增加,胞漿內(nèi)S100A1蛋白表達降低,P53蛋白表達增多。 2. Western Blotting檢測顯示,S100A1蛋白在人黑色素瘤細胞A375中弱表達,且與商業(yè)化的進口單抗相比,檢測效果無明顯差異。 3.外源性給予抗人S100B單克隆抗體,細胞增殖速度減慢,細胞凋亡增加,胞漿內(nèi)S100B蛋白表達降低,P53蛋白表達增多。 4. Western Blotting檢測顯示,S100B蛋白在人黑色素瘤細胞A375中有表達,但與商業(yè)化的進口單抗相比,檢測效果無明顯差異。 結(jié)論: 1.制備的抗人S100A1和S100B單克隆抗體既可以用于腫瘤細胞的Western Blotting檢測,又可發(fā)揮抑制腫瘤細胞的增殖,起到靶向治療作用,為相關(guān)疾病的診斷和治療提供了新的篩查手段。 2.抗人S100A1和S100B單克隆抗體對癌細胞的靶向治療作用,其機制可能是通過與S100A1和S100B蛋白結(jié)合,使胞漿內(nèi)S100A1和S100B蛋白表達減少,增加了野生型P53蛋白表達,從而促細胞凋亡,達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。
[Abstract]:S100A1 and S100B proteins are low molecular weight calcium binding proteins, all of which belong to the S100 protein family. The S100 protein family has a wide range of biological activities. Its main function is as a calcium binding protein involved in multiple cellular activity regulation, inhibit phosphorylation of protein kinase C pathway mediated by calcium signal transduction, affect hormone secretion, inhibit tubulin assembly and play an important role in cell proliferation and differentiation, muscle contraction, gene expression and secretion, and cell apoptosis. Research shows that the abnormal expression of S100 gene or protein in many diseases, such as Alzheimer's disease, and psoriasis, cystic fibrosis, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), cardiomyopathy and cancer, and closely related with the stage of the disease and prognosis. At present, the role of the S100 protein family in the development of tumor is not clear. However, it has been suggested that the S100 protein family affects the development of tumor by regulating the signal pathway. The members of the S100 protein family are highly expressed in a variety of tumor tissues, and their antibodies have an important potential role and significance in the diagnosis and treatment of tumor.
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 陽建福,張向陽,齊范;腎細胞癌組織中S100蛋白表達及與P53的關(guān)系[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2004年03期

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3 王國卿,封麗芳,夏作理;S100B蛋白生物學功能及在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用[J];中國臨床康復(fù);2004年28期

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本文編號：1342272