本文關鍵詞：hTERT（人端粒酶逆轉錄酶基因）轉染雪旺細胞后對其影響的實驗研究　出處：《大連醫(yī)科大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:1.采用7天左右的新生SD大鼠的雪旺細胞用脂質體轉染的方法進行hTERT的轉染，體外分離培養(yǎng)，探索安全、高效的脂質體轉染方法期望獲得永生化的雪旺細胞。 2.對轉染后的雪旺細胞和未轉染的雪旺細胞在細胞的增殖周期、形態(tài)、分泌功能方面的變化進行對比檢測，通過具體的實驗證明細胞永生化以后的優(yōu)勢和缺點，對永生化的雪旺細胞應用于神經(jīng)組織工程奠定基礎。 方法:1.選取出生后7天左右的SD大鼠，冰凍處死后碘伏浸泡消毒，取其坐骨神經(jīng)以及臂叢神經(jīng)，剪碎至1mm3大小的組織塊，雙酶消化法進行體外分離培養(yǎng)，待細胞生長到85%匯合密度時用低濃度胰酶快速消化傳代，30分鐘差速貼壁法進一步純化雪旺細胞，，用光學顯微鏡進行形態(tài)學觀察并拍照，S-100蛋白免疫熒光鑒定拍照。 2.將純化的雪旺細胞用含hTERT基因的質粒經(jīng)脂質體轉染法轉染雪旺細胞，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，待細胞生長滿80%密度時更換含G418（100ug/ml）的完全培養(yǎng)基，每3天換液1次，篩選2周，轉入含hTERT基因的質粒的細胞經(jīng)過篩選獲得陽性克隆后繼續(xù)傳代培養(yǎng)，傳代后的細胞一部分用于S-100蛋白免疫熒光鑒定，流式細胞儀檢測轉染后雪旺細胞以及未轉染細胞對照組的細胞周期，免疫印跡Western blot法分別檢測轉染雪旺細胞的的5、10、15、20代以及對照組未轉染雪旺細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子（NGF）的分泌。 結果:1.經(jīng)雙酶消化法可以獲得大量增殖的雪旺細胞，差速貼壁傳代后可以獲得典型的長梭形放射狀肩并肩排列的雪旺細胞，光鏡視野下雪旺細胞純度可以達到90%以上，成纖維細胞量少，經(jīng)S-100蛋白免疫熒光測定鑒定為雪旺細胞 2.脂質體轉染法轉染hTERT后光學顯微鏡觀察可見轉染后的雪旺細胞胞體體積大，長梭形。無規(guī)則貼壁生長，胞質黃色，經(jīng)S-100免疫熒光鑒定為雪旺細胞 3.流式細胞儀檢測轉染后的雪旺細胞周期發(fā)現(xiàn)S期細胞為42.76%，未轉染雪旺細胞S期為13.99%。 4.經(jīng)western blot檢測未轉染雪旺細胞和轉染雪旺細胞（5、10、15、20代）NGF的分泌，結果顯示NGF分泌量對比轉染前雪旺細胞NGF分泌量是增加的。 結論:1.使用7天左右的SD乳鼠取坐骨神經(jīng)及其臂叢神經(jīng)，采用雙酶消化，組織塊接種，差速貼壁法傳代可以獲得純度90%以上的雪旺細胞。 2.經(jīng)脂質體轉染法hTERT轉染雪旺細胞可以獲得純的雪旺細胞并且比未轉染的雪旺細胞分裂增殖增強，NGF分泌量增加。
[Abstract]:Objective: 1.. HTERT transfection was carried out by liposome transfection of 7 day old newborn SD rats, and cultured in vitro. A safe and effective liposome transfection method was explored to obtain immortalized Schwann cells.
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻】

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1 顧立強，朱家愷;神經(jīng)生長因子和雪旺氏細胞分泌的神經(jīng)營養(yǎng)活性物質促進周圍神經(jīng)再生的實驗研究[J];中華顯微外科雜志;1994年04期

本文編號：1341115