豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠狀病毒科,α冠狀病毒屬成員的豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以嚴重腹瀉,伴有嘔吐,脫水,食欲下降等特征的一種高度接觸性烈性腸道傳染病,主要危害仔豬,對于仔豬有極高的致病率以及致死率,嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。自1971年首次在英國發(fā)現(xiàn)以來,該病已經(jīng)陸續(xù)蔓延并傳播至全球多個國家和地區(qū),給養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。目前對于該病預(yù)防控制主要依靠疫苗免疫,在治療方法上卻尚未有重大突破。而關(guān)于PEDV的致病機制尤其是在凋亡信號通路領(lǐng)域的研究還不完全清楚,需要進一步研究。因此,研究PEDV致Vero凋亡的分子機制對尋找新的抗病毒途徑來說非常重要。本研究對PEDV感染Vero細胞的凋亡信號進行篩選并對凋亡信號與凋亡之間相關(guān)性進行研究,獲得以下結(jié)果:1.用間接免疫熒光試驗,Western blot以及流式細胞術(shù)篩選不同分子信號在PEDV感染Vero細胞中的變化情況。首先,用PEDV感染Vero觀察細胞的病變效應(yīng),用間接免疫熒光試驗觀察PEDV的增殖,在證實PEDV感染能夠?qū)е录毎∽兊幕A(chǔ)上,用流式細胞術(shù)檢測不同感染復(fù)數(shù)(MOI分別為0.1、0.5、1)的PEDV感染細胞24 h的細胞凋亡發(fā)生率,檢測了p53家族、ROS含量以及MAPK家族蛋白在不同感染時間下的含量變化。結(jié)果顯示,隨著感染復(fù)數(shù)的遞增,PEDV誘導(dǎo)Vero細胞的凋亡發(fā)生率也呈遞增趨勢。p53的Western blot試驗表明PEDV能夠顯著活化p-p53(Ser20),顯著增加CBP(cAMP-responsive element-binding protein)和MDM2(Murine double minute2 protein)的表達,對p53的間接免疫熒光試驗結(jié)果表明,在病毒感染期間,p53移位至細胞核發(fā)揮作用。MAPK家族的Western blot結(jié)果表明,PEDV感染能夠顯著活化p38 MAPK和SAPK/JNK,使p-p38 MAPK以及p-SAPK/JNK蛋白表達量增加。流式細胞術(shù)對不同PEDV感染時間的ROS含量檢測結(jié)果說明,PEDV能夠顯著引發(fā)ROS的累積,且這種累積效應(yīng)隨感染時間延長而越加明顯。2.用Western blot以及流式細胞術(shù)證實活化的ROS,MAPK以及p53家族與PEDV誘導(dǎo)Vero細胞凋亡之間的聯(lián)系,采用抑制試驗對本部分的結(jié)果加以驗證。首先,用p53特異性抑制劑Pifithrin-α(PFT-α)預(yù)處理Vero細胞1 h后感染PEDV 24 h,后采用流式細胞術(shù)、Western blot檢測凋亡率以及Bax、Bcl-2、FasL等凋亡相關(guān)蛋白的表達;其次,用p38 MAPK、JNK抑制劑SB203580以及SP600125預(yù)處理Vero細胞1 h后感染PEDV 24 h,檢測Bax、Bcl-2、FasL等凋亡相關(guān)蛋白的表達;最后,用抗氧化劑NAC以及PDTC處理Vero細胞1 h后感染PEDV 24 h,流式細胞術(shù)、Western blot檢測凋亡發(fā)生率以及Fas,FasL,Bax和Bcl-2等凋亡蛋白的相對表達量。結(jié)果表明,PEDV感染顯著增加Bax的相對表達量,減少Bcl-2的相對表達量,且PFT-α作用下能夠顯著逆轉(zhuǎn)由PEDV引起的Bax增多以及Bcl-2的降低,并上調(diào)Bax/Bcl-2比率,逆轉(zhuǎn)PEDV引起的凋亡發(fā)生率,表明抑制p53能夠顯著逆轉(zhuǎn)PEDV誘導(dǎo)的Vero細胞凋亡;與PEDV感染組相比,無論是SB203580還是SP600125處理組均無法改變Bcl-2、Bax和FasL的表達量,表明在抑制p38 MAPK和SAPK/JNK的情況下,無法逆轉(zhuǎn)由PEDV引起的Vero細胞凋亡,即p38 MAPK和SAPK/JNK的活化與PEDV誘導(dǎo)的Vero細胞凋亡無關(guān);與PEDV感染組相比,NAC、PDTC處理組的凋亡發(fā)生率也顯著降低,FasL/Fas的比例在PEDV感染組或是抗氧化劑處理中沒有顯著變化,而Bax/Bcl-2的比率顯著降低,表明PDTC和NAC處理明顯逆轉(zhuǎn)了PEDV誘導(dǎo)的細胞凋亡。進一步的抑制試驗表明,p53部分由ROS介導(dǎo),即ROS為p53上游。綜上所述,PEDV感染引起Vero產(chǎn)生細胞病變并以劑量依賴的方式誘導(dǎo)Vero細胞發(fā)生凋亡,且PEDV感染能夠誘導(dǎo)p53,p38 MAPK和SAPK/JNK的活化以及ROS的累積,活化的p53以及ROS參與PEDV誘導(dǎo)的Vero細胞凋亡,而p38 MAPK和SAPK/JNK的活化與PEDV誘導(dǎo)的Vero細胞凋亡無關(guān)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.651
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
第一章 文獻綜述
    1.1 豬流行性腹瀉病毒研究概述
        1.1.1 PEDV的分類以及理化性質(zhì)
        1.1.2 PEDV的基因組結(jié)構(gòu)及編碼蛋白
        1.1.3 PEDV的感染與致病機理
    1.2 細胞凋亡的研究進展
        1.2.1 細胞凋亡概述
        1.2.2 細胞凋亡的過程
        1.2.3 細胞凋亡的生理意義
        1.2.4 細胞凋亡涉及的信號通路
        1.2.5 病毒感染與細胞凋亡
    1.3 本研究的目的與意義
第二章 PEDV誘導(dǎo)Vero細胞凋亡的分子信號篩選
    2.1 材料
        2.1.1 細胞、病毒與抗體
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 相關(guān)試劑的配制
    2.2 方法
        2.2.1 Vero細胞培養(yǎng),復(fù)蘇,傳代及凍存
        2.2.2 PEDV的增殖
50 測定'>        2.2.3 PEDV TCID₅₀ 測定
        2.2.4 PEDV的接毒以及樣品制備
        2.2.5 PEDV感染Vero細胞的病變觀察
        2.2.6 間接免疫熒光觀察p53 的變化以及PEDV感染
        2.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡
        2.2.8 ROS的檢測
        2.2.9 Western blot檢測
        2.2.10 數(shù)據(jù)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 PEDV感染Vero細胞病變觀察
        2.3.2 IFA確定PEDV感染情況
        2.3.3 PEDV感染對細胞凋亡的影響
        2.3.4 PEDV感染對p53 的影響
        2.3.5 PEDV感染對MAPK家族的影響
        2.3.6 PEDV感染對ROS的影響
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 活化的凋亡信號與PEDV誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)性研究
    3.1 材料
        3.1.1 細胞、病毒與抗體
        3.1.2 試劑
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
        3.1.4 相關(guān)試劑的配制
    3.2 方法
        3.2.1 抑制試驗
        3.2.2 Western blot檢測抑制劑/抗氧化劑作用下的凋亡蛋白變化
        3.2.3 流式細胞儀檢測抑制劑/抗氧化劑作用下的細胞凋亡
        3.2.4 流式細胞儀檢測抑制劑/抗氧化劑作用下的ROS生成量
        3.2.5 MTT法檢測抑制劑/抗氧化劑的細胞毒性
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 抑制p53 對細胞凋亡以及凋亡蛋白的影響
        3.3.2 抑制p38 MAPK,SAPK/JNK對凋亡相關(guān)蛋白的影響
        3.3.3 使用抗氧化劑處理對凋亡以及凋亡蛋白的影響
        3.3.4 分別使用抗氧化劑、p53 抑制劑處理對p53 以及ROS含量的影響
        3.3.5 MTT試驗檢測各分子抑制劑對細胞活性的抑制作用
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 結(jié)論
參考文獻
致謝
個人簡歷

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