本文關鍵詞：TLR4基因沉默對兔頸動脈粥樣硬化斑塊血管生及細胞凋亡的影響及機制探討

  更多相關文章： Toll樣受體4 動脈粥樣硬化 RNA干擾 信號通路 血管新生 細胞凋亡

【摘要】：背景:動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心肌梗死、腦卒中和外周血管疾病的主要病理基礎,具有發(fā)病率高、致殘率高、治療費用高的特點。目前,心血管疾病位居人類各種致死病因的首位。因而動脈粥樣硬化的防治具有重大的經濟效益和社會效益。AS發(fā)病機制復雜,具有多種學說。目前研究認為AS是一種發(fā)生在血管壁的慢性炎癥性疾病,以血管壁內脂質沉積、炎癥細胞聚集為特征,免疫反應貫穿于AS的始終。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)作為一種模式識別受體參與了AS的形成和發(fā)展。易損斑塊(vulnerable plaque,VP)的破裂是急性心血管事件的主要原因,影響易損斑塊的原因包括:脂質核心的大小、纖維帽的厚度、炎癥反應和血流動力學等。研究發(fā)現(xiàn),動脈粥樣硬化斑塊中的新生血管是影響斑塊穩(wěn)定性的核心事件,并貫穿于AS發(fā)生發(fā)展乃至斑塊破裂的整個過程。動脈粥樣硬化斑塊中存在著多種細胞凋亡和壞死。因而抑制斑塊內血管新生和減少細胞凋亡是穩(wěn)定斑塊、防止斑塊破裂的重要手段。目的:新生血管和細胞凋亡在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展乃至破裂過程中發(fā)揮重要作用。本實驗擬應用si RNA沉默Toll樣受體4(TLR4)基因,觀察兔頸動脈粥樣斑塊中血管新生和細胞凋亡情況,為動脈粥樣硬化的防治提供新的機制和思路。方法:本研究分二部分1.應用高脂喂養(yǎng)聯(lián)合球囊損傷構建兔頸動脈粥樣硬化模型:健康長耳白兔48只,隨機分為對照組(control group)、模型組(model group)、TLR4陰性對照組(si RNA-negative group)、TLR4下調組(si RNA-TLR4 group)。(1)于喂養(yǎng)起始、5周、10周時取血,集中測定血脂水平;(2)留取頸動脈標本,進行病理學切片HE染色,測量內膜、中膜厚度,計算斑塊面積百分比;免疫組化測定斑塊內CD31、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表達情況;TUNEL法檢測斑塊內細胞凋亡情況;(3)Real-time PCR測定TLR4、NF-κB、HIF-1α、VEGF m RNA表達情況;(4)Western-blot測定TLR4、NF-κB、HIF-1α、VEGF蛋白表達情況;(5)ELISA測定血清TNF-α、IL-6水平。2.體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(human vein umbilical vein endothelial cell,HUVEC)。(1)脂多糖(LPS)以不同時間、濃度刺激HUVEC,觀察TLR4 m RNA表達達峰情況;(2)應用流式細胞儀技術,LPS以1μg/ml、10μg/ml刺激HUVEC0h、6h、24h、36h、48h觀察細胞凋亡情況;(3)設計合成兩條針對HUVEC TLR4的sh RNA,以慢病毒為載體包裝sh RNA-TLR4質粒轉染HUVEC,此后分為三組,control group、sh RNA1-TLR4 group和sh RNA2-TLR4 group。應用LPS 1μg/ml刺激24h,檢測TLR4 m RNA和蛋白表達情況,計算抑制效率;檢測NF-κB、HIF-1α、VEGF m RNA和蛋白表達情況(4)MTT法檢測LPS刺激前后control group、sh RNA1-TLR4 group和sh RNA2-TLR4 group三組細胞增殖情況;流式細胞儀測定細胞周期分布情況;(5)劃痕愈合實驗(Wound healing)實驗測定LPS刺激前后三組細胞遷移能力;(6)成管實驗觀察三組細胞成管能力。結果:1.(1)頸總動脈球囊損傷模型:手術成功率81.8%;(2)高脂喂養(yǎng)后兔血脂水平明顯升高,但各組同一時點無統(tǒng)計學差異(p0.05);(3)HE染色結果顯示,實驗組大部分頸總動脈有粥樣硬化斑塊形成,si RNA-TLR4組較其他各組內膜/中膜厚度比、斑塊面積百分比減少;免疫組化提示頸總動脈粥樣斑塊內有CD31、HIF-1α表達,且在si RNA-TLR4組的表達小于其他各組;TUNEL法染色提示,實驗各組斑塊內有細胞凋亡的發(fā)生,si RNA-TLR4組的表達小于其他各組(p0.05);(4)RT-PCR、Western-blot提示si RNA-TLR4組的TLR4、NF-κB、HIF-1α、VEGF表達水平較模型組下降(p0.05)。2.(1)LPS刺激HUVEC,激活TLR4具有濃度和時間依賴性,結果發(fā)現(xiàn)LPS 1μg/ml刺激24小時可使TLR4的表達達到峰值;(2)流式細胞術分析發(fā)現(xiàn),LPS 1μg/ml或10μg/ml刺激HUVEC 6小時會使細胞凋亡達到峰值;sh RNA組的細胞凋亡率下降(p0.05);(3)RT-PCR、Western-blot提示sh RNA-TLR4組的TLR4、NF-κB、VEGF表達下降(p0.05),而HIF-1α表達水平無明顯差異(p0.05);(4)細胞功能實驗發(fā)現(xiàn),sh RNA-TLR4組的細胞增殖能力下降(p0.05),成管能力低于對照組(p0.05),而遷移能力無統(tǒng)計學差異(p0.05)。結論:1.球囊損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)兔10周可以成功建立兔頸動脈粥樣硬化模型;si RNA-TLR4可通過抑制TLR4、NF-κB信號通路的活化減弱下游炎癥因子TNF-α、IL-6的表達而抑制炎癥反應,抑制HIF-1α、VEGF的表達而減少粥樣斑塊內新生血管的發(fā)生,并減少細胞凋亡的發(fā)生從而穩(wěn)定斑塊;TLR4基因沉默穩(wěn)定斑塊的作用獨立于降脂效應。2.LPS刺激HUVEC激活TLR4具有濃度和時間依賴性;LPS刺激HUVEC可使細胞達到凋亡,sh RNA-TLR4可通過抑制TLR4、NF-κB信號通路活化使細胞凋亡率下降;LPS刺激細胞后可通過活化TLR4、NF-κB信號通路使VEGF表達增加進而促進新生血管生成,而sh RNA下調TLR4后可弱化這種效應,并不通過HIF-1α傳遞這種效應;下調TLR4基因抑制細胞增殖,而對遷移能力無明顯影響。
【關鍵詞】：Toll樣受體4 動脈粥樣硬化 RNA干擾 信號通路 血管新生 細胞凋亡
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543.4
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語/符號說明12-14
• 前言14-17
• 研究現(xiàn)狀、成果14-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、TLR4基因沉默對兔頸動脈粥樣硬化斑塊血管新生和細胞凋亡的影響17-60
• 1.1 對象和方法17-33
• 1.1.1 實驗動物17
• 1.1.2 實驗材料及儀器17-21
• 1.1.3 實驗方法21-33
• 1.2 結果33-45
• 1.2.1 模型建立情況33-37
• 1.2.2 病理分析結果37-41
• 1.2.3 RT-PCR測定TLR4信號通路分子mRNA表達41-43
• 1.2.4 Western-blotting檢測TLR4信號通路分子蛋白的表達43-45
• 1.2.5 ELISA檢測血清TNF-α、IL-1β 表達水平45
• 1.3 討論45-59
• 1.3.1 動脈粥樣硬化模型的建立45-47
• 1.3.2 RNA干擾技術47-51
• 1.3.3 TLR4介導信號通路與動脈粥樣硬化51-53
• 1.3.4 TLR4介導信號通路與斑塊內血管新生53-57
• 1.3.5 TLR4介導信號通路與斑塊內細胞凋亡57-59
• 1.4 小結59-60
• 二、RNAi下調TLR4對人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移、成管及凋亡的影響60-88
• 2.1 對象和方法60-71
• 2.1.1 對象60-62
• 2.1.2 方法62-71
• 2.2 結果71-81
• 2.2.1 HUVEC生長曲線71-72
• 2.2.2 脂多糖對血管內皮細胞的形態(tài)學影響72
• 2.2.3 不同濃度LPS及不同刺激時間對HUVEC TLR4活性的影響72-73
• 2.2.4 shRNA-TLR4質粒的構建及慢病毒的包裝73
• 2.2.5 RT-PCR測定TLR4信號通路分子mRNA表達73-74
• 2.2.6 Western-blotting檢測TLR4信號通路分子蛋白的表達74-76
• 2.2.7 細胞功能實驗76-81
• 2.2.7.1 劃痕實驗76
• 2.2.7.2 MTT76-77
• 2.2.7.3 細胞周期檢測77-78
• 2.2.7.4 細胞成管能力檢測78-79
• 2.2.7.5 細胞凋亡檢測79-81
• 2.3 討論81-87
• 2.3.1 內皮細胞的主要生理功能及與動脈粥樣硬化的關系82
• 2.3.2 下調TLR4對HUVEC細胞TLR4信號通路的影響82-83
• 2.3.3 TLR4基因對內皮細胞增殖能力的影響及可能機制83-84
• 2.3.4 TLR4基因對內皮細胞遷移能力的影響及可能機制84
• 2.3.5 TLR4基因對內皮細胞成管的影響及可能機制84-85
• 2.3.6 TLR4基因對內皮細胞凋亡的影響及可能機制85-87
• 2.4 小結87-88
• 全文總結88-89
• 論文創(chuàng)新點89
• 局限性89-90
• 參考文獻90-100
• 發(fā)表論文和參加科研情況100-101
• 綜述 血管新生與動脈粥樣硬化研究進展101-111
• 綜述參考文獻106-111
• 致謝111

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Cost-effective method of siRNA preparation and its application to inhibit hepatitis B virus replication in HepG2 cells[J];World Journal of Gastroenterology;2005年09期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 丁士芳;新生血管與斑塊穩(wěn)定性的關系及VEGF基因干預的研究[D];山東大學;2007年

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本文編號：819304