本文關(guān)鍵詞：ZnT8在糖尿病發(fā)病和鑒別診斷中的作用及TNFAIP3對ZnT8的調(diào)節(jié)

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【摘要】：研究背景鋅離子在胰島β細胞的生物功能中發(fā)揮著非常重要的作用。鋅轉(zhuǎn)運體8 (Zinc transporter 8, ZnT8)是由SLC30A8基因編碼的鋅離子轉(zhuǎn)運蛋白,負責(zé)把鋅離子轉(zhuǎn)運和集聚在胰島素分泌顆粒中。ZnT8已經(jīng)被鑒定為2型糖尿病的危險因素,并且其自身免疫抗體(autoantibodies to ZnT8, ZnT8A)最近已經(jīng)被認(rèn)為是自身免疫性糖尿病可靠的生物標(biāo)志,可用于與健康狀態(tài)和2型糖尿病的診斷和鑒別診斷。其最常見的多態(tài)性在325位氨基酸(rs13266634,C/T),既與2型糖尿病易感性相關(guān),也與1型糖尿病自身抗體位點特異性有關(guān)。針對胰島細胞及自身抗原的抗體,比如ZnT8抗體、谷氨酸脫羧酶抗體、胰島素瘤相關(guān)抗體2和胰島素抗體,通常在糖尿病發(fā)病時出現(xiàn)、甚至早于發(fā)病,并且在發(fā)病后持續(xù)不同的一段時間。因此,自身免疫抗體是自身免疫性糖尿病風(fēng)險預(yù)測和診斷的有力工具。雖然酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和放射免疫法是檢測此類抗體的常用方法,但是存在著不能同時檢測多種抗體、有放射性、需要儀器設(shè)備等缺陷。另外一個不足之處是由于采用無細胞表達試劑盒和真核表達方法,ZnT8蛋白的生產(chǎn)和抗體檢測試劑的成本都比較高。SLC30A8基因的rs13266634突變和2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究不斷增加,但是各研究的結(jié)論不盡一致,部分原因在于單個研究樣本較小以及研究對象所屬族群不同。另外,細胞因子通過激活核因子κB (nuclear factor-KB, NF-κB)可以下調(diào)ZnT8的表達。鋅指蛋白腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白3(tumor necrosis factor α-induced protein-3, TNFAIP3)是NF-κB負性調(diào)節(jié)因子和炎癥和免疫調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)。雖然TNFAIP3在糖尿病作用的研究很多,但是在糖尿病人免疫細胞中的表達和對炎癥狀態(tài)下胰島細胞ZnT8表達的影響尚無相關(guān)報道。研究目的本研究的第一個目的是經(jīng)濟高效地表達包含C端主要抗原位點的兩個ZnT8突變體,而后用上述表達蛋白建立快速可靠的ZnT8抗體檢測方法,并且該方法增加其他自身抗原后可同時檢測多種自身免疫抗體。本研究另外一個目的是對SLC30A8的SNPrs13266634和2型糖尿病易感性進行meta分析。本研究的第三個目的是確定糖尿病人外周血免疫細胞中TNFAIP3的表達情況并評估胰島細胞中炎癥因子和TNFAIP3對炎癥狀態(tài)下ZnT8表達的調(diào)節(jié)作用。研究方法1.采用重疊延伸法對ZnT8進行定點突變,兩個ZnT8 C端抗原片段通過pCold Ⅱ系統(tǒng)在大腸桿菌中進行表達,而后利用表達的蛋白建立斑點金免疫滲濾法(dotimmunogold filtration assay, DIGFA)進行抗體檢測并以ELISA法為參考進行評價。2.通過檢索PubMed和Cochrane圖書館文獻并提取研究基本特征、基因型分布數(shù)據(jù)、比值比(odds ratio, OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval, CI)。分別利用校正OR和原始基因型分布數(shù)據(jù)進行相關(guān)性評估分析,并進行敏感性分析和累積meta分析以保證結(jié)果的可靠性,而后在不同的遺傳模型和最佳遺傳模型下對基因型分布數(shù)據(jù)進行薈萃分析。3.分別通過定量實時聚合酶鏈反應(yīng)和Western印跡實驗分析2型和成人遲發(fā)型糖尿病及健康對照人群外周血免疫細胞中TNFAIP3的表達變化；在NIT-1細胞中檢測炎癥對ZnT8的作用及炎癥條件下TNFAIP3過表達對ZnT8的調(diào)節(jié)。研究結(jié)果1.我們成功在大腸桿菌中表達出了兩個ZnT8抗原(325位氨基酸分別為精氨酸和色氨酸),并在此基礎(chǔ)上建立了DIGFA快速檢測方法,改進后即可同時檢測多種自身免疫抗體；其對ZnT8抗體檢測的結(jié)果與ELISA法相比并無明顯差異(p=0.22),靈敏度、特異度、準(zhǔn)確率、約登指數(shù)以及陽性和陰性似然比分別為64.3%,、96.4%、85.7%、0.607、18.0和0.370。2.我們在meta分析中共納入了來自于39篇研究文獻的55組數(shù)據(jù)(其中24篇文獻包含38組基因型分布數(shù)據(jù))。分別利用校正OR和基因型分布數(shù)據(jù)進行等位基因meta分析結(jié)果都顯示該多態(tài)性位點與總?cè)巳骸W洲人群、亞洲人群2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險相關(guān)(總?cè)巳海篛R=1.147/1.157,95% CI 1.114-1.181/1.135-1.180;亞洲人：OR=1.186/1.165,95% CI 1.150-1.222/1.132-1.198；歐洲人：OR=1.100/1.151,95% CI 1.049-1.153/1.120-1.183;所有p=0.00)而與非洲人無關(guān)(非洲人：OR=1.255/1.111,95%C10.964-1.634/0.908-1.360,p=0.091/0.305)。然后在不同的遺傳模型下對基因型分布數(shù)據(jù)進行了分析,都得出了類似的結(jié)論；最佳遺傳模型-共顯性模型分析顯示CC基因型攜帶者比CT和TT基因型攜帶者患2型糖尿病的風(fēng)險分別高出33.0%和16.5%。累積meta分析顯示隨著研究的納入總的估計精度越來越高。3.2型和成人遲發(fā)型糖尿病人中’TNFAIP3的mRNA和蛋白表達水平顯著下降且短病程(≤1年)比長病程(1年)下降更顯著。炎癥因子刺激可以下調(diào)ZnT8的蛋白表達水平并激活NF-κB途徑而TNFAIP3過表達可以拮抗炎癥條件下ZnT8表達的下調(diào)。研究結(jié)論1.pCold Ⅱ表達系統(tǒng)可以在大腸桿菌中表達出具有生物活性的ZnT8蛋白；以表達的ZnT8抗原為基礎(chǔ)建立的DIGFA方法可以快速、可靠、高效的檢測ZnT8抗體,且在硝酸纖維素膜上添加加其他自身抗原后后即可同時檢測多種自身免疫抗體。2.多態(tài)性位點rs13266634可能是亞洲和歐洲人群2型糖尿病易感性的重要遺傳因素,但與非洲人群沒有關(guān)聯(lián)。3.低水平的TNFAIP3可能參與了糖尿病的發(fā)生,一部分原因可能是正常水平的TNFAIP3通過抑制炎癥誘導(dǎo)的ZnT8表達下調(diào)從而阻止糖尿病的發(fā)生發(fā)展,反之TNFAIP不足造成炎癥反應(yīng)失控、ZnT8表達水平降低、胰島素分泌異常。
【關(guān)鍵詞】：鋅轉(zhuǎn)運體8 腫瘤壞死α誘導(dǎo)蛋白3 自身免疫性抗體 糖尿病 細胞因子 單核苷酸多態(tài)性 meta分析
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 ZnT8的原核表達及其在糖尿病鑒別診斷中的作用15-36
• 2.1 材料與方法15-30
• 2.2 結(jié)果30-34
• 2.3 討論34-35
• 2.4 結(jié)論35-36
• 第三章 ZnT8單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病易感性的meta分析36-60
• 3.1 材料與方法36-42
• 3.2 結(jié)果42-58
• 3.3 討論58-59
• 3.4 結(jié)論59-60
• 第四章 TNFAIP3在糖尿病中的作用及對ZnT8的調(diào)節(jié)60-78
• 4.1 材料與方法60-73
• 4.2 結(jié)果73-76
• 4.3 討論76-77
• 4.4 結(jié)論77-78
• 全文總結(jié)78-79
• 參考文獻79-95
• 文獻綜述 自身免疫性糖尿病和自身免疫抗體95-104
• 參考文獻99-104
• 博士期間發(fā)表的論文104-105
• 致謝105

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本文編號：734565