本文關(guān)鍵詞：BKCa表達調(diào)節(jié)對前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制

  更多相關(guān)文章： BKCa 整合素αvβ3 FAK 前列腺癌 增殖 遷移 侵襲 轉(zhuǎn)移 裸鼠

【摘要】：前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤。2012年全世界前列腺癌新確診病例110萬,位居各瘤種第二位。在發(fā)達國家前列腺癌新發(fā)病例位居各瘤種首位,在發(fā)展中國家位居第4位。隨著中國經(jīng)濟的發(fā)展、人口老齡化和人們生活方式的改變,前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前,前列腺癌篩查、早期診斷、手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌和免疫治療等綜合診療模式使患者的死亡率逐漸降低,但仍有相當一部分患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,需要不斷探索前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機制,尋找潛在的干預(yù)靶點。近年來研究發(fā)現(xiàn),離子通道在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。臨床上大約有13%的藥物都作用于離子通道,用于治療心血管和神經(jīng)系統(tǒng)異常等多種疾病。因此,探索將離子通道作為某些腫瘤治療的潛在靶點或預(yù)測指標具有重要的研究意義。BKCa是廣泛表達于心肌、血管平滑肌、神經(jīng)系統(tǒng)等全身多種組織和器官的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道。BKCa在可興奮細胞中主要通過調(diào)節(jié)細胞膜電位和細胞內(nèi)鈣信號,參與調(diào)控血管舒縮性和神經(jīng)興奮性等生理功能。近年來研究發(fā)現(xiàn),BKCa在多種腫瘤中呈高表達并參與了腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等許多惡性生物學(xué)行為。BKCa的編碼基因在晚期前列腺癌中的擴增率達16%,而在早期患者中無擴增。目前研究發(fā)現(xiàn),BKCa可以促進前列腺癌的增殖,但其分子機制尚未完全闡明。此外,除細胞增殖外BKCa是否也參與了前列腺癌的轉(zhuǎn)移、BKCa在體外的促腫瘤作用是否也能在體內(nèi)實現(xiàn)這些問題均有待回答。本課題從前列腺癌細胞系、荷瘤裸鼠體內(nèi)和臨床腫瘤組織和三個層面檢測了BKCa的表達和功能,初步探討了BKCa表達調(diào)節(jié)對前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲、體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制。第一部分BKCa在前列腺癌細胞和組織中的表達目的:比較BKCa在前列腺癌細胞和組織與正常細胞和癌旁良性組織中的表達差異,分析BKCa表達與前列腺癌臨床分期和腫瘤增殖標志物Ki67的相關(guān)性。方法:采用實時熒光定量PCR、Western blot和細胞免疫熒光檢測BKCa在前列腺癌細胞PC3和C4-2和正常前列腺上皮細胞RWPE-1中的表達。采用實時熒光定量PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)法檢測了前列腺癌組織與癌旁良性組織中BKCa的表達差異。采用免疫組織化學(xué)法檢測了前列腺癌組織中BKCa的表達與腫瘤分期和Ki67表達的相關(guān)性。結(jié)果:定量PCR和Western blot結(jié)果顯示BKCa的mRNA和蛋白質(zhì)在前列腺癌組織和細胞系中的表達均高于癌旁良性組織和正常前列腺上皮細胞系。免疫組化結(jié)果提示,BKCa在前列腺癌組織中的表達與增殖標志物Ki67呈正相關(guān)(r=0.461,p=0.0032),且BKCa的表達隨著前列腺癌分期的提高而增加,IV期前列腺癌中BKCa的表達明顯高于I-III期。結(jié)論:BKCa在前列腺癌組織和細胞中的表達明顯高于癌旁良性組織和正常上皮細胞,前列腺癌組織中BKCa與Ki67的表達呈正相關(guān),且腫瘤分期越晚BKCa表達越高。第二部分BKCa表達調(diào)節(jié)對前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的影響目的:探討B(tài)KCa表達調(diào)節(jié)對前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的影響方法:通過質(zhì)粒載體介導(dǎo)的BKCa上調(diào)體系和慢病毒載體介導(dǎo)的BKCa穩(wěn)定沉默體系實現(xiàn)對前列腺癌PC3和C4-2細胞系中BKCa表達的上、下調(diào),并采用MTT、EdU、平板克隆、細胞劃痕、Transwell遷移和侵襲實驗檢測BKCa表達上、下調(diào)對細胞增殖、遷移和侵襲的影響。采用前列腺癌PC3細胞構(gòu)建裸鼠皮下種植瘤模型和細胞尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型,檢測BKCa表達下調(diào)對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響及腫瘤組織中Ki67的表達變化。結(jié)果:BKCa表達上調(diào)后,前列腺癌細胞的細胞活力、DNA合成效率和克隆形成能力較對照組明顯提高,細胞劃痕愈合率、遷移和侵襲的細胞數(shù)量也較對照組顯著提高;BKCa表達下調(diào)則會抑制前列腺癌細胞的上述生物學(xué)行為。體內(nèi)研究顯示,BKCa表達下調(diào)后PC3細胞裸鼠種植瘤體積、質(zhì)量和Ki67表達較對照組明顯降低,尾靜脈注射的PC3細胞肺臟轉(zhuǎn)移數(shù)目明顯減少。結(jié)論:BKCa表達上調(diào)可促進前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力;BKCa表達下調(diào)則會抑制前列腺癌細胞的上述生物學(xué)行為,并抑制腫瘤在裸鼠體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移。第三部分BKCa調(diào)控前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機制目的:探討B(tài)KCa調(diào)控前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機制方法:采用膜片鉗技術(shù)驗證BKCa激動劑NS1619和抑制劑IBTX對PC3細胞鉀電流的作用,并檢測BKCa活性調(diào)節(jié)對前列腺癌增殖和遷移的影響。采用激光共聚焦免疫熒光和免疫共沉淀技術(shù)檢測BKCa與整合素αvβ3和FAK的共定位和相互作用情況,通過Western blot檢測BKCa表達調(diào)節(jié)對整合素αvβ3、FAK和p-FAK(Tyr397)表達的影響。采用整合素αvβ3封閉抗體LM609和FAK抑制劑Y15處理BKCa表達上調(diào)的PC3細胞,檢測細胞增殖和遷移變化,驗證整合素αvβ3/FAK通路在BKCa調(diào)節(jié)前列腺癌細胞增殖和遷移中發(fā)揮的作用。采用免疫熒光技術(shù)檢測臨床前列腺癌標本中的BKCa和p-FAK(Tyr397)表達的相關(guān)性。結(jié)果:BKCa的離子通透功能在促進前列腺癌細胞增殖和遷移中發(fā)揮一定作用但并非主要機制。BKCa與整合素αvβ3和FAK存在共定位和相互作用,BKCa表達調(diào)節(jié)對整合素αvβ3和FAK的表達無影響,但可通過與整合素αvβ3和FAK形成功能復(fù)合體,加強后兩者間的信號偶聯(lián)從而增加FAK的磷酸化,最終促進PC3細胞的增殖和遷移。阻斷αvβ3/FAK信號通路后可明顯削弱BKCa表達上調(diào)對細胞增殖和遷移的促進作用。在臨床前列腺癌標本中,BKCa和p-FAK(Tyr397)的表達呈正相關(guān)(r=0.517,p=0.0008)。結(jié)論:BKCa通過與FAK和整合素αvβ3形成功能復(fù)合體并加強后兩者之間的信號偶聯(lián)促進前列腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：BKCa 整合素αvβ3 FAK 前列腺癌 增殖 遷移 侵襲 轉(zhuǎn)移 裸鼠
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-13
• 英文摘要13-18
• 前言18-20
• 文獻回顧20-55
• 第一部分 前列腺癌研究現(xiàn)狀20-34
• 第二部分 鉀離子通道在腫瘤中的表達和作用34-45
• 第三部分BKCa在腫瘤中的研究進展45-55
• 第一部分 BKCa在前列腺癌細胞和組織中的表達55-69
• 1 材料55-57
• 1.1 細胞系55
• 1.2 前列腺癌組織55
• 1.3 儀器設(shè)備55-56
• 1.4 主要試劑56-57
• 2 方法57-63
• 2.1 細胞培養(yǎng)57
• 2.2 實時熒光定量PCR57-59
• 2.3 Western blot59-61
• 2.4 免疫組織化學(xué)61-62
• 2.5 免疫熒光62-63
• 2.6 統(tǒng)計分析63
• 3 結(jié)果63-67
• 3.1 BKCa在前列腺癌細胞和正常細胞系中的表達差異63-64
• 3.2 BKCa在前列腺癌和癌旁良性組織中的表達差異64-65
• 3.3 BKCa在前列腺癌組織中的表達與Ki67 的相關(guān)性65-66
• 3.4 BKCa在前列腺癌組織中的表達與腫瘤分期的關(guān)系66-67
• 4 討論67-69
• 第二部分 BKCa表達調(diào)節(jié)對前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的影響69-85
• 1 材料69-70
• 1.1 病毒和質(zhì)粒69
• 1.2 儀器設(shè)備69
• 1.3 主要試劑69-70
• 2 方法70-75
• 2.1 重組質(zhì)粒p IRES-BKCa的轉(zhuǎn)染70-71
• 2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染71
• 2.3 MTT實驗71
• 2.4 Ed U實驗71-72
• 2.5 平板克隆實驗72
• 2.6 細胞劃痕實驗72-73
• 2.7 Transwell實驗73-74
• 2.8 荷瘤裸鼠體內(nèi)實驗74
• 2.9 統(tǒng)計分析74-75
• 3 結(jié)果75-82
• 3.1 BKCa表達上調(diào)可促進前列腺癌細胞的增殖75-76
• 3.2 BKCa表達上調(diào)可促進前列腺癌細胞的遷移和侵襲76-77
• 3.3 慢病毒介導(dǎo)的BKCa-sh RNA下調(diào)效果驗證77-78
• 3.4 BKCa表達下調(diào)可抑制前列腺癌細胞的增殖78-80
• 3.5 BKCa表達下調(diào)可抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲80-81
• 3.6 BKCa表達下調(diào)可抑制前列腺癌裸鼠體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移81-82
• 4 討論82-85
• 第三部分 BKCa調(diào)控前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機制85-99
• 1 材料85-86
• 1.1 細胞系85
• 1.2 儀器設(shè)備85
• 1.3 主要試劑85-86
• 2 方法86-88
• 2.1 細胞培養(yǎng)86
• 2.2 激光共聚焦檢測86
• 2.3 免疫共沉淀86-87
• 2.4 膜片鉗實驗87-88
• 2.5 MTT實驗88
• 2.6 Transwell遷移實驗88
• 2.7 統(tǒng)計分析88
• 3 結(jié)果88-94
• 3.1 BKCa的離子通透功能在其促進前列腺癌細胞增殖和遷移中的作用88-90
• 3.2 BKCa與整合素 αvβ3 在前列腺癌PC3 細胞中的共表達和定位90-91
• 3.3 BKCa通過募集FAK至整合素 αvβ3 促進其磷酸化91-92
• 3.4 阻斷FAK信號通路可消除BKCa對細胞增殖和遷移的促進作用92-94
• 3.5 BKCa和p-FAK在臨床前列腺癌組織中的表達呈正相關(guān)94
• 4 討論94-99
• 小結(jié)99-100
• 參考文獻100-121
• 個人簡歷和研究成果121-122
• 致謝122

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本文編號：736944