發(fā)布時間：2017-08-25 02:10

  本文關(guān)鍵詞：胎盤生長因子調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在宮頸癌轉(zhuǎn)移中的作用研究

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【摘要】：研究背景宮頸癌是嚴重危害女性健康的重大惡性疾病,發(fā)病率為女性惡性腫瘤的第三位,僅次于乳腺癌和肺癌,也是導致女性死亡的第二大病因。我國是宮頸癌的高發(fā)地區(qū),有資料顯示,我國每年有近13.1萬例新發(fā)宮頸癌患者,近80%確診時已有浸潤轉(zhuǎn)移,每年有超過5萬例患者因?qū)m頸癌而死亡。目前,宮頸癌的治療主要依賴手術(shù)及放化療的綜合治療手段,雖然治療效果較為確切,但是復發(fā)轉(zhuǎn)移的風險仍然很高。研究報道,盡管經(jīng)過規(guī)范化的治療,宮頸癌的復發(fā)率占35%,且近90%是在初次治療后的3年內(nèi)復發(fā),而復發(fā)后的宮頸癌的轉(zhuǎn)移仍然是治療中遇到的最為棘手的問題,也是導致宮頸癌治療失敗及患者死亡的重要原因。同時,對于晚期宮頸癌患者,目前療效仍缺乏確切的治療手段。高危人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)性感染已確認是導致宮頸癌發(fā)生的最主要原因。近年來,隨著宮頸癌篩查手段的不斷進步以及HPV預防性疫苗的應(yīng)用,發(fā)達國家的宮頸癌發(fā)生率和死亡率均有明顯的下降。盡管已有針對HPV的預防性疫苗及可靠的宮頸癌篩查手段,但目前宮頸癌的發(fā)病仍然呈上升的趨勢,因此,進一步認識宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程,了解其浸潤轉(zhuǎn)移的機制,仍然是發(fā)展有效治療策略的重要措施。宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移是導致其治療失敗及患者死亡的重要原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的第一步,也是導致宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移的重要原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細胞失去其表面標記,逐漸轉(zhuǎn)化為具有活動能力的間質(zhì)細胞,并失去其表面標記,獲得具有浸潤轉(zhuǎn)移能力的過程,其表現(xiàn)為上皮細胞特征性的表面標記表達E-cadherin表達下調(diào),而間質(zhì)細胞表面標記如vimentin上調(diào),同時,出現(xiàn)細胞活動能力增加,與周圍組織的粘附能力下降,使細胞獲得向遠處組織浸潤轉(zhuǎn)移的能力。大量研究證實,EMT除了在胚胎發(fā)育及器官發(fā)生、創(chuàng)傷修復及組織重建、器官纖維化、慢性炎癥等中發(fā)揮作用外,在腫瘤干細胞形成及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著極為重要的作用。有趣的是,在EMT在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中,呈現(xiàn)一個動態(tài)變化的過程:EMT能夠促進腫瘤的局部浸潤,但是腫瘤向遠處器官轉(zhuǎn)移過程中,首先需要形成間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(Mesenchymal-Epithelial Transition,MET),進而轉(zhuǎn)變?yōu)閑mt,從而導致腫瘤發(fā)生遠處器官轉(zhuǎn)移。這種可逆的變化表明emt不是受到遺傳或者表觀遺傳學的調(diào)控,而是受來自于腫瘤微環(huán)境(tumormicroenvironment,tme)中的各種相關(guān)因素調(diào)控的。而emt在宮頸癌的轉(zhuǎn)移中同樣發(fā)揮著重要的作用,研究發(fā)現(xiàn),hpv感染、致癌基因激活及腫瘤微環(huán)境的改變均可以導致宮頸癌emt的發(fā)生。而hpv感染引起的宮頸微環(huán)境的改變可能在這一過程中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤微環(huán)境(tme)是腫瘤細胞賴以生存的外部條件,由成纖維細胞,免疫細胞,細胞外基質(zhì)及由其分泌的各種細胞因子成分等構(gòu)成。研究認為腫瘤微環(huán)境在抑制腫瘤免疫,提高腫瘤耐藥、促進腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移方面起著重要的作用,腫瘤局部微環(huán)境為腫瘤的發(fā)展提供了一個適宜的局部環(huán)境,為腫瘤的進展轉(zhuǎn)移復發(fā)耐藥,提供滋生的良好環(huán)境。腫瘤微環(huán)境中的細胞因子,如腫瘤壞死因子(tnf-α),白細胞介素(il-1,6,8),轉(zhuǎn)化生長因子(tgfβ),血管生成因子(vegfplgf)以及一些非腫瘤細胞,包括巨噬細胞,淋巴細胞等,均在促進腫瘤的浸潤進展方面發(fā)揮著重要的作用。hpv感染是導致宮頸癌的重要原因,也是導致宮頸局部微環(huán)境改變的重要因素,hpv持續(xù)感染導致宮頸局部持續(xù)的炎癥狀態(tài),誘導并激活多種炎癥細胞分泌多種細胞因子及化學成分,形成一個復雜的宮頸陰道微環(huán)境,在促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中,發(fā)揮著重要的作用。hpv感染后,引起宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化,是一個漸進發(fā)展的過程,而emt是導致轉(zhuǎn)化宮頸上皮進展為侵襲性腫瘤的重要因素。宮頸癌是由宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervicalintraepithelialneoplasia,cin)細胞向具有侵襲轉(zhuǎn)移能力的惡性細胞逐漸發(fā)展而來,某些cin病變,有可能逆轉(zhuǎn)為正常宮頸上皮,這一可逆性的改變與emt類似,提示emt和cin存在某種聯(lián)系,可能都是受到宮頸微環(huán)境所調(diào)控的。而hpv感染是宮頸癌的主要元兇,也是導致宮頸微環(huán)境改變的最重要因素。hpv感染可能通過改變宮頸局部微環(huán)境進而促進宮頸癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),胎盤生長因子(placentagrowthfactor,plgf)在肺癌及乳腺癌中的表達明顯上調(diào),同時,通過激活plgf特異性受體flt-1可以促進某些腫瘤發(fā)生emt。已有研究證實了hpv感染導致宮頸微環(huán)境改變,誘導各種炎癥細胞聚集和炎癥介質(zhì)的釋放,這其中包括plgf,這些變化可能進一步促進了已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)化的瘤變上皮向浸潤癌的發(fā)展。同時,hpv感染后的宮頸上皮組織中,可以檢測到plgf的mrna表達明顯上調(diào);而在宮頸癌組織中,研究發(fā)現(xiàn),plgf及其mrna的表達水平均明顯高于癌旁組織。因此,plgf作為hpv感染后,宮頸微環(huán)境中的重要成分,在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。胎盤生長因子(plgf)是血管生成因子家族(vegf)家族的成員之一,與其他血管生成因子家族不同的是,plgf在正常生理狀態(tài)下幾乎不表達或表達量極低,而在缺血、炎癥及腫瘤等病理狀態(tài)下,其表達量明顯上調(diào),提示plgf可能作為疾病狀態(tài)下的重要生物學標記或疾病預后的重要生物學監(jiān)測指標。研究發(fā)現(xiàn),plgf作為一種多功能的細胞因子,可能通過多種方式促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展,包括1.促進腫瘤血管形成2.促進腫瘤細胞的增殖3.誘導形成腫瘤局部免疫耐受狀態(tài)等.因此認為plgf可能作為預測腫瘤嚴重程度及預后的機具價值的生物學標記。flt-1作為plgf的特異性受體,在plgf的功能發(fā)揮上,具有重要的意義,有研究發(fā)現(xiàn),plgf只對表達flt-1受體的腫瘤具有促進浸潤遷移的作用,而對于不表達flt-1的腫瘤細胞不具有功能。在局部缺血及炎癥性疾病以及許多腫瘤包括非小細胞肺癌(nsclc),前列腺癌,乳腺癌和結(jié)腸癌,肺腺癌,肝細胞癌,膠質(zhì)母細胞瘤,多發(fā)性骨髓瘤和腎母細胞瘤中,均可以觀察到plgf及其受體flt-1表達的上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn),plgf可以通過激活emt信號促進包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。而在宮頸癌的研究中,研究報道證實plgf在宮頸癌組織中明顯高表達,但是plgf在宮頸癌中的作用及機制,未見相關(guān)報道。因此,闡明plgf在宮頸癌中的作用及其機制,為進一步深入理解宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移的機制,開發(fā)新的宮頸癌篩查手段及治療策略均具有重要的意義。研究目的通過檢測plgf及其受體flt-1及emt相關(guān)蛋白e-cadherin、vimentin在宮頸癌及癌旁正常宮頸組織中的表達特點,分析研究各蛋白表達與宮頸癌分期、分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性;同時,檢測了宮頸癌患者血清及陰道盥洗液中plgf的表達水平與宮頸癌分期及hpv感染狀態(tài)之間的相關(guān)性。采用培養(yǎng)的宮頸癌siha細胞系,研究plgf對宮頸癌細胞的促遷移作用及對emt相關(guān)蛋白的表達調(diào)控作用及其可能機制。為進一步了解宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移機制,開發(fā)新的宮頸癌篩查手段及治療策略提供實驗依據(jù)。研究方法1.采用he染色技術(shù),確認所收集的組織標本取材的準確性,對所取得的準確的標本納入后續(xù)的研究。2.采用免疫組織化學染色技術(shù),檢測plgf、受體flt-1及emt相關(guān)蛋白e-cadherin及vimentin,在宮頸癌及癌旁組織的表達情況,并分析它們之間的相關(guān)性。3.采用westernblot技術(shù)進一步檢測宮頸癌及癌旁正常組織中,plgf、受體flt-1及emt相關(guān)蛋白e-cadherin及vimentin,在宮頸癌及癌旁組織的表達情況。4.采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(elisa)法檢測宮頸癌患者及正常對照人群血清及陰道盥洗液中,分析plgf的表達水平與hpv感染狀態(tài)及腫瘤分期之間的關(guān)系。5.采用體外培養(yǎng)的宮頸癌siha細胞系,應(yīng)用transwell法,分析研究plgf刺激對宮頸癌細胞遷移作用。6.采用westernblot方法,分析plgf處理后的siha細胞中,emt相關(guān)蛋白表達的變化。7.采用shrna-flt-1慢病毒載體感染siha細胞,用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達shrna-flt-1的細胞株。8.采用正常培養(yǎng)的siha細胞及穩(wěn)定沉默flt-1的siha細胞,并應(yīng)用transwell法及westernblot技術(shù),分析研究敲除flt-1后,plgf對siha細胞促進遷移作用及emt相關(guān)蛋白表達情況的影響。9.采用培養(yǎng)的正常siha細胞,預先給予erk/mapk信號通路抑制劑處理后,采用transwell及westernblot技術(shù),觀察分析erk/mapk信號被抑制后,plgf對siha細胞促進遷移作用及emt相關(guān)蛋白表達情況的影響。結(jié)果1.在110例宮頸癌組織標本中,plgf及其受體flt-1的表達明顯高于對應(yīng)的癌旁對照組織,它們表達的陽性率分別為61.8%和60.9%;而e-cadherin的表達明顯降低占61.8%,vimentin呈高表達陽性率為59.1%。相關(guān)性分析表明,plgf及flt-1在宮頸癌組織中的高表達與e-cadherin的低表達及vimentin的表達上調(diào)密切相關(guān)(p0.01,r=-0.618;p0.01,r=0.450);westernblot檢測進一步證實,plgf、flt-1及vimentin在宮頸癌組織中的表達明顯高于癌旁對照組織,而e-cadherin的表達則明顯低于癌旁組織。2.宮頸癌患者血清plgf的水平明顯高于正常對照組(22.96±0.90ng/mlvs9.926±1.049ng/m,p0.001),且隨著腫瘤分期的進展而升高(p0.001);在陰道盥洗液中,患者plgf的表達水平也明顯高于對照組(24.80±0.73ng/mlvs11.29±0.90ng/ml,p0.001);而血清及陰道盥洗液之間或?qū)m頸癌i期和ii期患者之間,plgf的表達無明顯差異(p0.05)。3.hpv感染陽性患者陰道盥洗液中plgf的表達水平明顯高于hpv感染陰性組(25.74±0.6258ng/mlvs11.40±0.7439ng/ml,p0.05)。4.體外實驗證實:plgf處理后的siha細胞的遷移率明顯上調(diào),而采用shrna-flt-1沉默flt-1的表達后,可以明顯下調(diào)siha細胞的遷移(p0.05),同時,plgf可以明顯下調(diào)e-cadherin的表達并上調(diào)vimentin的表達,但沉默flt-1的表達后,可以逆轉(zhuǎn)上述蛋白的表達。5.ERK/MAPK信號通路抑制劑PD98059處理siha細胞后,能夠明顯抑制PLGF對siha細胞的促進遷移作用,并能夠抑制PLGF對siha細胞EMT相關(guān)蛋白的調(diào)控作用。結(jié)論1.PLGF及其受體Flt-1在宮頸癌組織中的表達明顯高于癌旁對照組織,且與EMT相關(guān)蛋白E-cadherin在宮頸癌組織的低表達及vimentin的高表達密切相關(guān),提示PLGF可能通過調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達,發(fā)揮促進宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移的作用,因此,追蹤PLGF的表達變化有可能為預測腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)提供預警。2.PLGF在宮頸癌患者血清及陰道盥洗液中的含量明顯高于正常對照組,且與宮頸癌分期密切相關(guān);而HPV感染患者陰道盥洗液中PLGF的表達水平明顯高于HPV陰性人群,提示HPV感染可能是促進PLGF表達升高的重要因素,因此,動態(tài)監(jiān)測陰道分泌物中PLGF的表達變化,可能為HPV感染導致宮頸癌提供佐證,而PLGF有可能成為新的宮頸癌篩查標記。3.PLGF通過激活其受體Flt-1促進宮頸癌siha細胞的遷移及調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達;抑制ERK/MAPK信號通路能夠抑制PLGF的上述功能,提示PLGF/Flt-1/ERK/MAPK通路在促進宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移中,發(fā)揮著重要的作用,有望為臨床抑制宮頸癌轉(zhuǎn)移提供新的藥物研究靶點。
【關(guān)鍵詞】：胎盤生長因子 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 腫瘤微環(huán)境 腫瘤轉(zhuǎn)移
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-13
• 中文摘要13-18
• 第一章 前言18-26
• 第二章 宮頸癌組織中PLGF及其受體Flt-1 的表達與EMT相關(guān)蛋白表達之間的相關(guān)性研究26-43
• 2.1 材料與方法26-30
• 2.2 統(tǒng)計學分析30
• 2.3 結(jié)果30-40
• 2.4 討論40-43
• 第三章 PLGF在宮頸癌患者外周血及陰道盥洗液中的表達及其與宮頸癌分期之間的關(guān)系43-52
• 3.1 材料及方法43-45
• 3.2 統(tǒng)計學分析45
• 3.3 結(jié)果45-49
• 3.4 討論49-52
• 第四章 PLGF通過激活Flt-1 信號通路促進宮頸癌siha細胞的遷移及調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達52-67
• 4.1 材料與方法53-56
• 4.2 統(tǒng)計學分析56
• 4.3 結(jié)果56-63
• 4.4 討論63-67
• 第五章 PLGF/Flt-1 通過激活ERK/MAPK信號通路促進宮頸癌細胞遷移及調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達67-75
• 5.1 材料及方法67-69
• 5.2 統(tǒng)計學分析69-70
• 5.3 結(jié)果70-73
• 5.4 討論73-75
• 全文總結(jié)75-76
• 參考文獻76-86
• 文獻綜述 胎盤生長因子在腫瘤中的作用及機制研究進展86-105
• 參考文獻97-105
• 攻讀學位期間的成果105-106
• 致謝106-107

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本文編號：734441