本文關鍵詞：RIP3硝化在大鼠心腦缺血再灌注損傷中的作用及紅花黃色素的干預研究

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【摘要】：研究背景缺血性心臟疾病和腦卒中通過介入或者藥物溶栓等方法實現(xiàn)血運重建是心腦的重要措施,也極大地改善了患者的預后,但是由此導致的缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury, IRI),在一定程度上削弱了介入或者藥物溶栓在臨床上的應用效果。IRI現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)迫使人們開始心腦保護的相關基礎和臨床研究。缺血再灌注損傷涉及到諸多環(huán)節(jié),包能量代謝障礙、鈣超載、氧自由基損傷和細胞凋亡等。如何抑制細胞凋亡進而減輕或避免IRI,尋求減輕IRI的靶點,探索其分子機制,找到新的心腦保護藥物和策略,成為研究的熱點問題。一氧化氮(Nitric oxide, NO)參與了眾多疾病的生理和病理生理過程,是一種易擴散的生物活性小分子,在調(diào)控氧化還原信號和細胞功能中具有重要作用。激活依賴環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)信號通路是NO的經(jīng)典途徑,進而調(diào)節(jié)機體的生理作用；NO還可以通過與蛋白質(zhì)親核巰基發(fā)生翻譯后修飾進一步生成亞硝基硫醇(S-nitrosothiols, RSNO)達到修飾調(diào)節(jié)細胞功能的目的,因此研究蛋白質(zhì)巰基亞硝基化及其相關信號轉(zhuǎn)導機制將為臨床提供新的減輕IRI的干預手段和方法。在缺血缺氧等氧化應激條件下,體內(nèi)會過量生成NO與O2-,短時間內(nèi)瀑布樣反應生成大量過氧亞硝基陰離子ONOO",作用于細胞內(nèi)靶蛋白質(zhì)酪氨酸等殘基,使其發(fā)生硝化,起到調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的作用。硝化過多的現(xiàn)象見于多種疾病的病理損傷過程,如心血管疾病、部分炎癥、缺血性腦血管疾病和退行性神經(jīng)病變等。蛋白質(zhì)硝化是指由NO自由基與02-迅速反應,在短時間內(nèi)生成大量ONOO-,對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基進行硝化生成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT),從而改變其結(jié)構(gòu)和功能。RIP3(Receptor interacting protein3,RIP3)作為細胞應激傳感分子,在調(diào)控細胞凋亡、細胞壞死通路中發(fā)揮重要作用,那么RIP3的硝化在IRI的是如何變化的呢?該硝化在整個調(diào)控過程中扮演何種角色,以及作用的靶點在什么地方都是需要進行研究的。減輕缺血再灌注損傷的手段和藥物較多,其中傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有很大優(yōu)勢,而紅花黃色素(safflor yellow, SY)具有清除自由基、改善心腦細胞能量代謝、減輕鈣超載、抑制細胞凋亡等多種作用,可減輕IRI。但其作用的分子機制是否在抑制硝化中發(fā)揮重要作用呢?我們通過動物在體和器官離體實驗,應用生物化學與分子生物學技術和形態(tài)學手段進行了相關檢測和系列研究。第一部分：RIP3硝化對在體大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及紅花黃色素干預研究研究背景缺血再灌注損傷(ischemia and reperfusion injury, IRI)是指組織因缺血發(fā)生可逆性、可存活的損傷,缺血區(qū)域再次獲得血運重建后原來功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷卻進一步加重的現(xiàn)象。缺血性心臟病在恢復再灌注后,部分可發(fā)生再灌注心律失常、心肌舒縮功能障礙、代謝異常及心肌超微結(jié)構(gòu)的改變,其中氧自由基(oxygen free radicals,OFR)的過量產(chǎn)生是導致心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)的重要因素之一。在缺血缺氧后體內(nèi)會過量生成NO與O2-,短時間內(nèi)迅速反應生成大量過氧亞硝基陰離子(ONOO-),作用于細胞內(nèi)靶蛋白質(zhì)酪氨酸等殘基,使其發(fā)生硝化,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能。硝化過多則參與介導各種缺血性心腦損傷、炎癥和退行性神經(jīng)病變等多種疾病的病理過程。受體相互作用蛋白3(Receptor interacting protein 3, RIP3)作為最早被鑒定出來的蛋白激酶之一,屬于RIPs家族的一員,其過量表達導致細胞凋亡。多種缺血壞死性疾病有RIP3的參與,但RIP3及其共價修飾(硝化)在MIRI中的研究較少,尤其是應用分子生物學的技術和手段以及通過在體心肌缺血再灌注(Ischemia-reperfusion, I/R)模型研究,尚無相關的報道。紅花黃色素(safflor yellow,SY)可以抑制自由基產(chǎn)生或清除自由基、改善心肌組織能量代謝、減輕細胞內(nèi)鈣超載和抑制細胞凋亡等多種作用,從而減輕MIRI。但SY保護MIRI的內(nèi)在機制,尤其是分子信號通路研究報道極少,‘是目前亟待解決的問題。在此基礎上,我們提出：1.RIP3硝化在MIRI中是否發(fā)揮重要重要作用?2.中藥紅花黃色素的,心肌保護作用是否與RIP3硝化及RIP1磷酸化(活化)等具有相關性。研究目的1.觀察SY后處理在體缺血再灌注大鼠心肌的血流動力學、組織病理學的變化情況。2.給予不同劑量SY進行干預后處理,檢測RIP3硝化(nitration of receptor interacting protein 3, N-RIP3)及RIP1磷酸化(phosphorylation of receptor interacting protein 1,P-RIP1),研究SY對在體大鼠MIRI保護作用的分子機制。研究方法1.清潔級健康SD大鼠108只,雄性,隨機分為6組(n=18)：假手術組(Sham組)、心肌缺血再灌注組(I/R組)、SY低劑量組(SY 10 mg/kg組)、SY中劑量組(SY 30 mg/kg組)、SY高劑量組(SY 90 mg/kg組)、依達拉奉組(Eda 10 mg/kg組)。通過在體夾閉冠狀動脈左前降支(left anterior descending of coronary artery, LAD)的方法制備MIRI模型。Sham組只穿縫線,不結(jié)扎。I/R組及藥物干預各組在再灌注前1 min經(jīng)分別經(jīng)股靜脈注射0.9%氯化鈉注射液、不同劑量SY和Eda, SY及Eda均用等量0.9%氯化鈉注射液稀釋；Sham組在對應時間點注射等量0.9%氯化鈉注射液。2.在缺血即刻(To)、缺血30 min末(T1)、再灌注30 min末(T2)、再灌注60 min末(T3)、再灌注90 min末(T4)和再灌注120 min末(T5)等6個時間點記錄大鼠心肌功能學指標：心率(HR)、左室發(fā)展壓(left ventricular development pressure, LVDP)、左室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、左室內(nèi)壓上升和下降速率最大值(maximum change rate of left ventricular pressure rise and fall,±dp/dtmax)。3.再灌注120 min末穿刺右心室抽取靜脈血,采用比色法測血漿中丙二醛(malonaldehyde, MDA)的含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme MB, CK-MB)的活性；4.實驗結(jié)束處死動物,取心臟切片后給予2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride, TTC)染色計算心肌梗死面積(%),HE染色觀察心肌組織學改變,Western Blot法測定硝化的受體相互作用蛋白3(nitration of receptor interacting protein 3, N-RIP3)、磷酸化的受體相互作用蛋白1(phosphorylation of receptor interacting protein 1, P-RIP1)的水平。研究結(jié)果1.各組缺血前血流動力學指標HR, LVEDP、LVDP、±dp/dtmax相比較,差異無統(tǒng)計學意義；2.與sham組相比,I/R組及不同劑量藥物干預組大鼠在缺血30 min末、再灌注90 min末和120 min末的HR、LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的絕對值降低,LVEDP升高,再灌注120 min末的血漿MDA含量升高、CK-MB活性升高,SOD活性下降,N-RIP3、 P-RIP1增高,心肌凋亡細胞比例增高；3.與I/R組相比,高劑量SY組及Eda組大鼠在再灌注90 min末及120 min末LVDP、 +dp/dtmax、-dp/dtmax的絕對值升高,LVEDP降低。再灌注120 min末的血漿MDA含量、CK-MB活性降低,SOD活性升高,N-RIP3、P-RIP 1表達降低,心肌梗死面積及心肌凋亡細胞比例降低,心肌病理改變減輕。SY低劑量組和中劑量組各項指標與I/R組相比較,差異無統(tǒng)計學意義,心肌病理改變差異不明顯；4.與低劑量、中劑量組相比,高劑量組在再灌注90 min末及120 min末,LVDP、 dp/dtmax、-dp/dtmax的絕對值升高,LVEDP降低,再灌注120 min末的血漿MDA含量降低、CK-MB活性下降、SOD活性升高,N-RIP3、P-RIP1降低,心肌梗死面積及心肌凋亡細胞比例顯著降低。研究結(jié)論1.在體大鼠MIRI中,氧自由基(OFR)過量生成,RIP3硝化增多并被激活,促進下游信號分子RIP1的磷酸化,加重MIRI2.SY具有清除OFR作用,進而減少RIP3硝化及RIP1的磷酸化,對MIRI起到保護作用,且具有量效關系。第二部分：RIP3硝化對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及紅花黃色素干預研究研究背景蛋白質(zhì)翻譯后的共價修飾有磷酸化、糖基化、乙�；拖趸�。在細胞信號轉(zhuǎn)導中,對蛋白質(zhì)的磷酸化進行了廣泛而深入的研究,而最近,蛋白質(zhì)硝化也引起了關注。蛋白質(zhì)硝化是指由NO自由基與02-迅速反應,在短時間內(nèi)生成大量ONOO-,對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基硝化生成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)。如果機體清除能力下降,不能清除過量的3-NT,體內(nèi)多種有重要功能的蛋白功能將會受損或活性下降,不但使線粒體和DNA損傷,也會使酪氨酸磷酸化受到抑制,從而誘導細胞凋亡和衰老等級聯(lián)反應過程。在某些病理條件下如應激和炎癥等,在肺、肝臟和血管內(nèi)皮中可以檢測到3-NT,體內(nèi)酪氨酸硝化的產(chǎn)生與分布決定于3-NT生成與定位。ONOO-生物學特性異常活躍,是一種強氧化劑,而且具有硝化功能,可以與生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)何核酸等反應。在正常情況下,蛋白質(zhì)硝化反應存在很多正常組織中,信號途徑的調(diào)節(jié)與體內(nèi)低水平的蛋白質(zhì)硝化反應有關。但是,過度的硝化則參與介導心腦血管疾病、炎性反應、缺血性腦損傷以及退行性神經(jīng)紊亂等多種疾病的病理損傷過程。在體研究已經(jīng)證實紅花黃色素能通過減少RIP3硝化和RIP1的磷酸化而發(fā)揮保護作用。那么,在去除了神經(jīng)內(nèi)分泌等因素情況下,紅花黃色素能否依然發(fā)揮可靠的心肌保護作用呢?如果有作用的話,是否也是抑制了RIP3的硝化來實現(xiàn)信號調(diào)控的呢?我們通過應用離體大鼠缺血再灌注損傷模型,給予不同劑量SY,研究其心肌保護作用強度及內(nèi)在機制等。研究目的1.觀察不同劑量SY對離體缺血再灌注大鼠心肌的血流動力學、心肌梗死面積、組織病理學、心肌細胞凋亡情況。2.觀察N-RIP3及P-RIP1變化,闡明SY對離體心肌MIRI保護作用的分子信號傳導機制。研究方法1.清潔級SD大鼠60只隨機分為6組：空白對照組(A組),缺血再灌注組(B組)、低劑量SY組(10μmol/L, C組),中劑量SY組(30μmol/L, D組),高劑量SY組(90μmol/L, E組),依達拉奉組(F組)。大鼠肝素化,戊巴比妥麻醉后,取心,剪斷大血管,主動脈保留3-4 mm,懸吊于Langendorff'恒壓逆行灌注裝置,左心耳處剪小口,置入水囊連接換能器,經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換器與計算機相連記錄數(shù)據(jù)。2.心功能學指標監(jiān)測同第一部分,監(jiān)測缺血前即刻(T0)、缺血30 min末(T1)、再灌注30 min末(T2)、再灌注60 min末(T3)、再灌注90 min末(T4)和再灌注120 min末(T5)六個時間點的HR、LVDP、LVEDP和±dp/dtmax。3.測量心肌梗死面積、評估心肌細胞損傷及凋亡情況等方法學同第一部分。4.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)聯(lián)合Western Blotting分析RIP1磷酸化、RIP3硝化水平。研究結(jié)果1.與對照組相比,IR組心功能指標明顯減低,與IR組相比,藥物干預組左心室心功能指標明顯改善,中劑量SY組效果較好。2.與IR組相比,空白對照組、低劑量SY組、中劑量SY組和高劑量SY組以及依達拉奉組心肌梗死面積顯著降低,而中劑量SY組梗死面積較小。各劑量藥物處理組,在再灌注120 min末,心肌勻漿組織檢測SOD活性升高,MDA含量下降。3.光鏡下,對照組心肌纖維排列規(guī)則,界限清楚、橫紋明顯規(guī)則,IR組心肌纖維排列紊亂,且心肌纖維部分斷裂明顯,橫紋不明顯,各劑量SY組可見心肌纖維排列漸規(guī)則,斷裂漸少,而依達拉奉組心肌纖維排列尚整齊,但較稀疏,可見橫紋。可見棕黃色核的TUNEL陽性細胞,并且可見細胞空泡化,以IR組最為明顯,SY、依達拉奉組心肌細胞凋亡比例下降；4.離體大鼠心肌再灌注120min末,各藥物干預組的RIP3、RIP1表達水平均降低,中、高劑量SY及依達拉奉的RIP3硝化水平降低,低劑量SY組的RIP3表達水平及RIP3硝化水平高,而高劑量SY組和依達拉奉組的RIP3表達水平低,低、高劑量SY組和依達拉奉組的RIPl表達量低。IR時,RIP3硝化水平上升,SY或依達拉奉干預后,可降低RIP3的硝化水平。RIP1表達水平上升,且不同SY濃度對RIPl表達水平影響不同。研究結(jié)論1.大鼠離體心臟缺血再灌注損傷時,RIP3的硝化水平升高,并促進下游RIP1磷酸化水平升高,二者誘導細胞凋亡,加重心肌損傷；2.SY通過降低RIP3硝化、RIP1磷酸化,減輕自由基損傷,降低心肌細胞凋亡比例,對缺血再灌注損傷心肌發(fā)揮保護作用,且其作用呈劑量依賴性。第三部分：PYK2的巰基亞硝基化在缺血再灌注損傷的相關性及活化位點研究研究背景富含脯氨酸的蛋白酪氨酸激酶2(PYK2,也稱作細胞粘附激酶-β, RAFTK,或CADTK)是粘著斑激酶家族非受體酪氨酸激酶成員,PYK2參與G蛋白偶聯(lián)受體的信號轉(zhuǎn)導,煙堿型乙酰膽堿受體,細胞膜去極化和應力。PYK2由FERM,激酶結(jié)構(gòu)域,富含脯氨酸的區(qū)域,和粘著定位(脂肪)域組成。位于FERM和激酶結(jié)構(gòu)域之間第402位酪氨酸的自身磷酸化促使PYK2的活化。有研究顯示,PYK2酪氨酸的磷酸化在細胞中的分布已經(jīng)由其酪氨酸磷酸化抗體檢測到。它的主要自身磷酸化位點是402位的酪氨酸。缺血可以導致PYK2的活化,缺血短時期誘導的鈣離子大量內(nèi)流,導致細胞內(nèi)鈣超載。內(nèi)源性的NO是通過一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸合成的,它與蛋白分子的半胱氨酸巰基亞硝基化(S-亞硝基化)相互聯(lián)系。S-亞硝基化,NO類化合物可以對同型半胱氨酸側(cè)鏈進行共價修飾,是一種重要的翻譯后修飾,對蛋白質(zhì)功能具有重要的的調(diào)控作用。細胞內(nèi)Ca2+的靶向蛋白有磷酸酶,蛋白激酶,和NOS。nNOS主要應答鈣-鈣調(diào)蛋白信號通路。有意義的是,一些研究表明,PYK2是一種被雌激素誘導的ROS激活,對氧化還原敏感的激酶。但PYK2的激活機制還沒有完全闡明。根據(jù)以上所述,我們推測,在細胞經(jīng)過OGD后,通過NMDAR介導的Ca2+內(nèi)流導致了鈣-鈣調(diào)素信號化合物的形成。這種化合物使得內(nèi)源性的NO合成增加,導致PYK2蛋白S-亞硝基化,而激活PYK2,最終導致了細胞死亡。在本研究中,我們首先檢測,一氧化氮供體GSNO使培養(yǎng)的細胞內(nèi)過表達的PYK2巰基亞硝基化,其次,在大鼠缺血復灌不同的時間點可以誘導PYK2的巰基亞硝基化和活化。研究目的1.檢測外源性一氧化氮使PYK2巰基亞硝基化。2.檢測缺血再灌注誘導的內(nèi)源性NO導致PYK2巰基亞硝基化和活化。3.檢測介導PYK2巰基亞硝基化的位點。研究方法1.利用PYK2-SPORT6質(zhì)粒為模板構(gòu)建PYK2突變體質(zhì)粒。PYK2酶活性區(qū)域的每個半胱氨酸(C)殘基突變?yōu)楦拾彼?G)。2.應用生物素轉(zhuǎn)化法測定PYK2的巰基亞硝基化情況。3.免疫印跡對P-PYK2(活化的PYK2)進行檢測。4.DAPI染色檢測凋亡樣細胞死亡。研究結(jié)果1.在培養(yǎng)的HEK-293細胞中,用GSNO處理,過表達的PYK2能形成一個顯著的亞硝基化蛋白,且與GSNO呈濃度和時間依賴性,NEM可以與蛋白質(zhì)的自由巰基反應使之烷基化從而封閉巰基。給予NEM后,用GSNO處理的細胞,PYK2的巰基亞硝基化被完全抑制。當加入nNOS抑制劑7NI時,再給予鈣載體A23187, PYK2的巰基亞硝基化也被抑制。2.通過對膜上PYK2巰基亞硝基化條帶密度的測定,與野生型相比,C534G突變體下降約86%。3. OGD 6 h和12h后野生型PYK2的亞硝基化使得其功能活性有著顯著的提升,C534G突變體與野生型相比,PYK2的亞硝基化和磷酸化水平明顯下降,在過表達C534G突變體PYK2的SH-SY5Y細胞中,細胞凋亡明顯減少。研究結(jié)論1.PYK2能被外源性NO (GSNO)或nNOS產(chǎn)生的內(nèi)源性NO亞硝基化。2.PYK2的534位半胱氨酸為其承擔巰基亞硝基化的位點。3.PYK2的巰基亞硝基化參與了其活化。
【關鍵詞】：紅花黃色素 心肌缺血再灌注 RIP3 RIP1 硝化 紅花黃色素 心肌缺血再灌注 RIP3 硝化 富含脯氨酸的蛋白酪氨酸激酶2 缺糖缺氧 亞硝基化
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

• 中文摘要7-17
• 英文摘要17-27
• 符號說明27-29
• 前言29-39
• 參考文獻35-39
• 第一部分 RIP3硝化在在體大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用及紅花黃色素的干預研究39-75
• 研究背景39-40
• 1.材料與方法40-55
• 2.結(jié)果55-57
• 3.討論57-63
• 4.結(jié)論63-64
• 附圖表64-71
• 參考文獻71-75
• 第二部分 RIP3硝化在離體大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用及紅花黃色素的干預研究75-98
• 研究背景75-76
• 1.材料與方法76-79
• 2.結(jié)果79-81
• 3.討論81-86
• 4.結(jié)論86-87
• 附圖表87-94
• 參考文獻94-98
• 第三部分 PYK2巰基亞硝基化在缺血再灌注損傷中的相關性及位點鑒定98-114
• 研究背景98-99
• 1.材料與方法99-102
• 2.結(jié)果102-104
• 3.討論104-105
• 4.結(jié)論105-106
• 附圖表106-111
• 參考文獻111-114
• 致謝114-115
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄115-116
• 學位論文評閱及答辯情況表116-117
• 英文文章1117-135
• 英文文章2135-147

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳偉;金鳴;樸永哲;李金榮;;紅花黃色素緩解大鼠心肌缺血的作用[J];中草藥;2007年09期

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本文編號：706597