本文關(guān)鍵詞：兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡中Epstein-Barr病毒基因異常表達(dá)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分Epstein-Barr病毒在兒系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹�(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)研究[研究背景及目的]系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種T細(xì)胞依賴的、免疫復(fù)合物介導(dǎo)的累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病,可使包括心、肝、腎等多個(gè)器官以及神經(jīng)、血液等多個(gè)系統(tǒng)受累,嚴(yán)重影響人類健康。兒童SLE可見于兒童的各個(gè)年齡時(shí)期,但很少5歲以前發(fā)病,青春期增多,新生兒亦可見。兒童SLE的發(fā)病機(jī)理、臨床特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果與成人SLE類似,但兩者仍有顯著的差異,兒童SLE臨床表現(xiàn)更不典型,首發(fā)癥狀各異,易發(fā)生誤診,有潛在的致命性,如不及時(shí)治療,預(yù)后遠(yuǎn)比成人嚴(yán)重。兒童SLE的病因尚不清楚,可能是遺傳、性激素、病毒感染等環(huán)境因素的共同作用下,自身組織細(xì)胞發(fā)生或免疫活性細(xì)胞發(fā)生改變,從而失去自身耐受性,造成機(jī)體免疫調(diào)節(jié)失常。近年來研究發(fā)現(xiàn)EBV(Epstein-Barr virus, EBV)可能是與SLE發(fā)病關(guān)系較為密切的感染因素之一。EBV最先從非洲兒童惡性淋巴瘤體中被發(fā)現(xiàn),屬于Y亞科皰疹病毒。EBV具有嗜B淋巴細(xì)胞性,急性感染后可引起短暫B淋巴細(xì)胞克隆增殖,在免疫功能正常個(gè)體,這種B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)可很快被T淋巴細(xì)胞包括細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞抑制,終生保持EBV潛伏感染狀態(tài)。SLE患者存在嚴(yán)重免疫功能紊亂,不能完全像健康正常者一樣有效控制EBV潛伏感染,SLE遺傳易感者或SLE患者感染EBV后,EBV將作為一個(gè)持續(xù)存在的威脅因素,最終導(dǎo)致某些病理狀況的發(fā)生。EBV基因組帶有84個(gè)開放的閱讀框,編碼60種病毒蛋白。EBV基因按病毒表達(dá)的時(shí)期分為4期：潛伏期、即刻早期、早期和晚期結(jié)構(gòu)基因。潛伏基因包括核抗原(EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C和EBNA-LP)、潛伏期膜蛋白家族(LMP1、LMP2A和LMP2B)、EBV編碼的RNA(EBER1和EBER2)。即刻早期基因是潛伏基因被激活后最早表達(dá)的一種病毒蛋白,屬于轉(zhuǎn)錄因子家族,包括BZLF1和BRLF1等,能啟動(dòng)其他EBV活化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)。早期基因有BMLF1、BHRF1、BMRF1、BALF5和BARF1等,是與復(fù)制病毒基因組的相關(guān)酶有關(guān),包括編碼解旋酶、引物酶和DNA聚合酶等相應(yīng)基因。晚期結(jié)構(gòu)基因包括BCRF1、BLLF1等,包括編碼結(jié)構(gòu)蛋白的糖蛋白(gp350、 gp85、gp110)的基因和編碼衣殼蛋白的基因。EBV在體內(nèi)存在兩種感染狀態(tài)：裂解型感染及潛伏型感染。國(guó)內(nèi)外大量的研究表明EBV與SLE的關(guān)系密切：1、SLE中EBV血清學(xué)異常：國(guó)內(nèi)外大量的研究表明SLE患者中EBV血清學(xué)陽性率及EBV活化的早期抗原-D抗體、EBV-EA抗體、VCA-IgG抗體等陽性率等均顯著高于健康對(duì)照組；2、SLE患者EBV病毒載量明顯異常：SLE患者血液中EB病毒的載量明顯高于正常人群,說明在SLE患者體內(nèi)EB病毒處于失控狀態(tài)；3、SLE患者EBV-DNA異常。國(guó)內(nèi)大量的研究均表明SLE患者EBV-DNA有著較高的陽性率；4、SLE患者EBV基因表達(dá)的異常。Brian D. Poole等人發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞EBV潛伏期基因LMP-1及裂解期基因BLLF1, BcRF1表達(dá)均顯著增加。提示SLE患者中EBV基因表達(dá)異常,EBV可能參與了SLE的發(fā)病過程。近年來的研究表明EBV可通過分子模擬、分子功能模擬、T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子旁路機(jī)制、表觀遺傳等多種方式參與SLE發(fā)病。既往研究多是以成人SLE為研究對(duì)象,而EBV原發(fā)性感染多發(fā)生于兒童時(shí)期,因此分析兒童SLE與EBV感染之間的相關(guān)性可能更有助于探索兩者之間關(guān)系。根據(jù)上述研究基礎(chǔ),并進(jìn)一步研究EBV與兒童SLE相關(guān)性,本實(shí)驗(yàn)探討兒童SLE患者與健康對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC) EBV潛伏期基因及裂解期基因的表達(dá)情況,以及予以EBV感染后的兩組PBMC EBV潛伏期基因及裂解期基因表達(dá)情況,試圖探討EBV基因在兒童SLE中的表達(dá)情況及可能致病作用,為SLE的致病機(jī)理及臨床治療提供新的思路。[方法]1.分離外周血單核細(xì)胞和提取DNA：抽取SLE患兒及健康對(duì)照組肝素抗凝靜脈血30m1。用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離PBMC,提取其中15m1靜脈血分離出的PBMC的DNA。2. B95.8 EBV株與1×106/mlPBMC按1：1共同培養(yǎng)12天后,用Trizol(?)試劑盒提取總RNA。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Real-time fluorescence quantitative PCR, q-PCR)檢測(cè)PBMCEBV DNA拷貝數(shù)。4.實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法(Reverse transcription PCR, RT-PCR)檢測(cè)EBV相關(guān)基因：EBV核抗原1(EBNA1),潛伏膜蛋白1(LMP1),潛伏膜蛋白2(LMP2),即刻裂解基因(BZLF1),晚期裂解基因(BcRF1),晚期裂解基因(BLLF1)。[結(jié)果]1、兒童SLE PBMC EBV DNA拷貝數(shù)SLE患兒組平均為(658.6±205.7)拷貝/μg,其中活動(dòng)組(785.2±173.3)拷貝/μg,非活動(dòng)組(586±193.1)拷貝/μg；而健康對(duì)照組(40.1±11.6)拷貝/Lg。經(jīng)t檢驗(yàn)分析,SLE患兒組和健康對(duì)照組存在顯著性差異(P0.01),SLE患兒組PBMC EBV DNA拷貝數(shù)是健康對(duì)照組的10余倍；方差分析表明,活動(dòng)組、非活動(dòng)組、對(duì)照組在3組間存在顯著性差異(P=0.000,F=79.346),兩兩比較進(jìn)一步提示SLE患兒組內(nèi)活動(dòng)組和非活動(dòng)組存在顯著性差異(P=0.005)。2、兒童SLEPBMC EBV DNA拷貝數(shù)與SLEDAI無相關(guān)性(r=0.053,P=0.826)。3、兒童SLEPBMC中潛伏期基因和裂解期基因的異常表達(dá)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)了20例SLE患兒及12例健康對(duì)照PBMCEBV基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)10例患兒和1例健康對(duì)照檢測(cè)到潛伏期基因LMP1表達(dá),兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(p0.05)。4例患兒和1例對(duì)照檢測(cè)到潛伏期基因LMP2表達(dá),13例患兒和3例對(duì)照檢測(cè)到潛伏期基因EBNA1表達(dá),3例患兒和1例對(duì)照檢測(cè)到裂解期基因BCRF1表達(dá),5例患兒和1例對(duì)照檢測(cè)到裂解期基因BLLF1表達(dá),但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(p0.05)。4、EBV感染后兒童SLEPBMC中潛伏期基因和裂解期基因的異常表達(dá)用EBV感染SLE患兒和健康對(duì)照PBMC后,RT-PCR檢測(cè)EBV基因表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLE患兒組潛伏期基因LMP1、LMP2、EBNA-1和裂解期基因BCRF1、 BLLF1的表達(dá)均顯著高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為L(zhǎng)MP1:1.011±0.141比0.383±0.180, t=10.680, P=0.000; LMP2:1.001±0.093 比 0.208±0.082, t=25.109,P=0.000; EBNA-1:1.012±0.163 比 0.188±0.129, t=14.591, P=0.000; BCRF1:1.015±0.167比0.344±0.161, t=11.268,P=0.000; BLLF1:1.038±0.264比0.117±0.081, t=14.513,P=0.000).[結(jié)論]1、兒童SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中EBV DNA拷貝數(shù)顯著增加,活動(dòng)期SLE的EBV DNA拷貝數(shù)高于非活動(dòng)期患者,提示SLE患兒體內(nèi)EBV活躍。2、兒童SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中潛伏期基因LMP1表達(dá)顯著異常。3、EBV培養(yǎng)后兒童SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中潛伏期基因LMP1、LMP2、 EBNA-1和裂解期基因BCRF1、BLLF1表達(dá)異常。4、兒童SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞EBV基因的表達(dá)異常,EBV基因可能參與了SLE的發(fā)病過程。第二部分Epstein-Barr病毒潛伏膜蛋白1(LMP-1)在兒童狼瘡性腎炎腎臟中表達(dá)的研究[研究背景及目的]當(dāng)SLE患兒出現(xiàn)蛋白尿、血尿、紅細(xì)胞管型、白細(xì)胞管型等尿沉渣多樣改變,以及水腫、高血壓(排除其他因素引起)和(或)腎功能異常等腎實(shí)質(zhì)損害表現(xiàn)時(shí),即可診斷為狼瘡性腎炎(Lupus Nephritis,LN)。SLE患兒LN發(fā)生率較高,并且隨著SLE病程的延長(zhǎng),兒童SLE發(fā)生LN的機(jī)會(huì)逐年增加。多數(shù)報(bào)道兒童SLE初診時(shí)約50%左右伴有LN,起病2年內(nèi)達(dá)70%～80%,4年后可超過90%。如作腎活檢,則幾乎100%的患兒均有不同程度的腎臟病理改變。根據(jù)2003年國(guó)際腎臟病學(xué)會(huì)和腎臟病理學(xué)會(huì)聯(lián)合制定的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(ISN/RPS分型),LN可分為：Ⅰ型(輕微系膜型LN)、Ⅱ型(系膜增生性LN)、Ⅲ型(局灶性LN)、Ⅳ型(彌漫性LN)、V型(膜性LN)及Ⅵ型(終末硬化性LN)。LN的病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚,研究認(rèn)為包括以下可能機(jī)制：(1)循環(huán)免疫復(fù)合物在腎臟組織的沉積。(2)原位免疫復(fù)合物的形成。(3)自身抗體對(duì)腎臟的直接損害作用。(4)激活局部補(bǔ)體,產(chǎn)生自細(xì)胞趨化因子,造成局部炎癥損害,此外還可形成膜攻擊復(fù)合物直接攻擊基底膜,造成腎小球和毛細(xì)血管通透性增加,造成腎臟損傷。(5)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞分泌自身抗體,引起腎臟損傷。(6)其他因素如激肽\緩激肽系統(tǒng),單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等在LN中也起到一定作用。國(guó)外的研究表明,LMP-1能夠通過多種機(jī)制加重SLE的自身反應(yīng)性,包括直接激活B細(xì)胞,增強(qiáng)B細(xì)胞活化的協(xié)同刺激信號(hào),刺激B細(xì)胞活化因子(BAFF)的產(chǎn)生,能夠協(xié)助打破自我耐受等。LMP-1可與CD40L結(jié)合,在細(xì)胞膜上募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(Tumor necrosiS factor receptor associated factor, TRAF)家族成員,激活信號(hào)傳導(dǎo)途徑,使EBV異常克隆增殖,并誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞大量活化。Bishop等人試驗(yàn)證明LMP-1可活化具有遺傳素質(zhì)的個(gè)體的B淋巴細(xì)胞,產(chǎn)生大量自身抗體,并導(dǎo)致腎臟損害。LMP-1誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞活化過程中腫瘤壞死因子受體結(jié)合因子-6(TRAF-6)起到重要作用。LMP-1可直接激活凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),也可通過一些信號(hào)傳導(dǎo)途徑上調(diào)受感染B淋巴細(xì)胞中bcl-2的表達(dá),抑制B細(xì)胞凋亡,促進(jìn)B細(xì)胞存活,使自身抗體不斷產(chǎn)生,導(dǎo)致SLE的發(fā)生發(fā)展。EBV抗原、EBV基因組和病毒抗原的血清學(xué)的研究均表明EBV參與了SLE的發(fā)病,第一部分研究發(fā)現(xiàn)EBV-LMP1基因在SLE發(fā)病中有重要作用,但LMP1在是否參與了LN的發(fā)病機(jī)理尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)選用兒童LN患者作為研究對(duì)象,研究LN患兒臨床癥狀、腎臟病理分級(jí)和抗體表達(dá)與LMP1的相關(guān)性,試圖探討LMP-1與兒童LN的發(fā)病的相關(guān)性。[方法]實(shí)驗(yàn)組來源于海南省婦幼保健院皮膚科與中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心小兒腎臟�？�,收取了自2009年1月1日至2013年11月收治的狼瘡性腎炎患兒51例,收集患者完整的臨床資料。免疫組化方法檢測(cè)LN及正常對(duì)照組腎臟組織中LMP-1的表達(dá),并與患者的臨床狀態(tài)、腎臟病理分級(jí)、臨床癥狀及抗體表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。[結(jié)果]1.免疫組化檢測(cè)LN患兒腎臟組織中LMP-1的表達(dá)51例LN患兒和12例健康對(duì)照腎臟組織中檢測(cè)LMP-1蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)40例(78.4%)LN患兒和2例(16.7%)健康對(duì)照表達(dá)呈陽性,LN患兒腎臟的LMP-1表達(dá)的陽性率與健康對(duì)照相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。2.LN患者LMP-1的表達(dá)和不同的臨床狀態(tài)的關(guān)系LMP-1的表達(dá)與LN的病程無相關(guān)性。為了研究LMP-1的陽性率與臨床癥狀的關(guān)系,我們檢測(cè)了初發(fā)和復(fù)發(fā)LN患者的腎臟組織。15例初發(fā)患者中,有12例(80%)LMP-1表達(dá)陽性,36例復(fù)發(fā)患者中,有28例(77.8%)LMP-1表達(dá)陽性,初發(fā)和復(fù)發(fā)LN患者LMP-1表達(dá)無顯著性差異(P=1.000)。我們進(jìn)一步檢測(cè)了合并細(xì)菌感染和未合細(xì)菌并感染的LN患兒的LMP1表達(dá),發(fā)現(xiàn)20例未合并感染的LN患兒中有16例(80%)患兒LMP1表達(dá)陽性,而31例合并感染的LN患兒中有有24例(77.4%)患兒LMP1表達(dá)陽性。未合并感染和合并感染的LN患兒的腎臟組織LMP1表達(dá)陽性率無顯著性差異(P=1.000)。3.LN患者LMP-1的表達(dá)和腎臟病理分級(jí)的相關(guān)性為了研究LN的分級(jí)與EBV感染是否有關(guān)系,我們檢測(cè)了腎臟不同病理分級(jí)LN患兒的LMP1陽性率。Ⅱ型LN患兒LMP1陽性率為57.1%,Ⅲ型LN患兒LMP1陽性率為66.7%,Ⅳ型和Ⅲ+Ⅴ型LN患兒LMP1陽性率為分別80%和83.3%,Ⅳ+V型LN患兒LMP1陽性率為91.7%,是所有類型中陽性率最高的。LN患者LMP-1的表達(dá)和腎臟病理分級(jí)的Spearman相關(guān)分析表明,二者Spearman相關(guān)系數(shù)=1,P0.01,提示LMP1陽性率與LN的分級(jí)可能有正相關(guān)性,EBV感染可能參與了LN的發(fā)病機(jī)理。4 LN患者LMP-1的表達(dá)和臨床癥狀的關(guān)系我們也研究了LN患兒腎臟組織中LMP1陽性率與不同的臨床癥狀的關(guān)系。40例LMP1陽性和11例LMP1陰性的LN患兒的貧血、高凝狀態(tài)、低蛋白血癥、低補(bǔ)體血癥、血尿+蛋白尿的臨床表現(xiàn)無顯著性差異(P0.05)。然而,LMP1陽性LN患兒與LMP1陰性LN患兒比較,腎功能不全、血尿、蛋白尿的發(fā)生率顯著性升高(P0.05)。5.LN患者LMP-1的表達(dá)和自身抗體的關(guān)系我們研究了自身抗體與LN患兒LMP-1的相關(guān)性,這些結(jié)果提示,LMP1陽性LN患兒與LMP1陰性LN患兒比較,只有anti-Sm抗體的陽性率在LMP1陽性LN患兒中顯著升高(P=0.009), ANA, anti-RNP, anti-Jo-1, anti-dsDNA, anti-SSA and anti-SSB抗體在兩組間無顯著性差異(P0.05)。[結(jié)論]1、LMP-1與LN發(fā)病相關(guān),但與病毒感染狀態(tài)無關(guān)。2、LMP-1與LN患兒腎臟損害程度和類型呈陽性相關(guān),EBV感染可能提高LN的腎臟分級(jí)。3、LMP-1陽性LN患者的腎功能不全、血尿、蛋白尿臨床癥狀出現(xiàn)的陽性率更高。這些結(jié)果提示LN患兒的臨床癥狀與LMP-1的表達(dá)呈陽性相關(guān),EBV感染可能加重LN的臨床表現(xiàn)。4、EBV感染可能通過增加Anti-Sm抗體的產(chǎn)生而成為L(zhǎng)N病情加重的因素。第三部分Epstein-Barr病毒潛伏膜蛋白1在兒童狼瘡性腎炎患者中表達(dá)的比較[研究背景及目的]通過實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)、腎臟免疫組化和ELISA3種方法研究?jī)和钳徯阅I炎(LN)中EB病毒(EBV)潛伏膜蛋白1(LMP-1)的表達(dá),試圖探討LMP-1在兒童LN的致病機(jī)制。[方法]41例LN患兒和12例健康對(duì)照組,分別用RT-PCR法、免疫組化方法、ELISA法檢測(cè)兩組外周血單核細(xì)胞(PBMCs)、腎臟組織及血清中LMP-1的表達(dá)。[結(jié)果]① RT-PCR法、免疫組化法、ELISA法檢測(cè)LN患兒和健康對(duì)照者的陽性率分別為(65.9% vs 8.3%,95.1% vs 16.7%,22.0% vs 8.3%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；②3種方法檢測(cè)LMP-1的表達(dá),免疫組化檢測(cè)陽性率高于其它兩組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。[結(jié)論]兒童LN中存在EBV潛伏期基因LMP-1表達(dá)異常,其中腎臟組織中表達(dá)陽性率最高,提示LMP-1可能參與了兒童LN的發(fā)病。
【關(guān)鍵詞】：兒童 狼瘡性腎炎腎炎 Epstein-Barr病毒感染 潛伏感染膜蛋白1(Latent membraneprotein LMP-1) 兒童 狼瘡性腎炎 潛伏膜蛋白1 EB病毒 紅斑狼瘡 系統(tǒng)性 EB病毒感染 基因表達(dá) 兒童
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R725.9
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-24
• 第一部分 EpstenBarr病毒在兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹�(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)研究24-60
• 前言24-30
• 1 材料與方法30-41
• 2 結(jié)果41-50
• 3 討論50-53
• 4 結(jié)論53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 第二部分 Epstein-Barr病毒潛伏膜蛋白1(LMP-1)在兒童狼瘡性腎炎腎炎腎臟中表達(dá)的研究60-80
• 前言60-63
• 1 材料與方法63-69
• 2 結(jié)果69-73
• 3 討論73-74
• 4 結(jié)論74-75
• 參考文獻(xiàn)75-80
• 第三部分 Epstein-Barr病毒潛伏膜蛋白1在兒童狼瘡性腎炎患者中表達(dá)的比較80-92
• 前言80-81
• 1 材料與方法81-87
• 2 結(jié)果87-88
• 3 討論88-89
• 參考文獻(xiàn)89-92
• 綜述92-111
• 參考文獻(xiàn)102-111
• 縮略詞表111-112
• 致謝112-113
• 在讀期間發(fā)表論文論著113-115

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 譚國(guó)珍,曾凡欽,陳宜芳,魏菁,毛越蘋;系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者B淋巴細(xì)胞中EB病毒感染與bc1-2表達(dá)的相關(guān)研究[J];中華風(fēng)濕病學(xué)雜志;2002年04期

  本文關(guān)鍵詞：兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡中Epstein-Barr病毒基因異常表達(dá)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：454270