本文關(guān)鍵詞：激活TRPV1誘導(dǎo)自噬在血管平滑肌細(xì)胞泡沫化中作用及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的:動(dòng)脈粥樣硬化形成以泡沫細(xì)胞在血管壁上沉積為特征性病理表現(xiàn)。泡沫細(xì)胞的增多促進(jìn)了粥樣斑塊的發(fā)展和不穩(wěn)定性,導(dǎo)致心腦血管事件的發(fā)生。動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的首要致病因素。泡沫細(xì)胞的主要來源是單核巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)。早期動(dòng)脈粥樣硬化病變中的泡沫細(xì)胞主要來源于巨噬細(xì)胞,而中晚期病變中泡沫細(xì)胞主要來源于VSMC(45%為VSMC來源,只有30%呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞標(biāo)記)。相比于巨噬細(xì)胞性泡沫細(xì)胞形成的大量研究,來源于VSMC的泡沫細(xì)胞在近年才受到關(guān)注,其形成的具體調(diào)控機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。泡沫細(xì)胞的形成是由于胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量含膽固醇酯核心的脂滴而使得細(xì)胞呈現(xiàn)類似泡沫樣的外觀改變。以往認(rèn)為脂滴的代謝主要在胞漿內(nèi)進(jìn)行,由系列脂肪水解酶(如脂肪甘油三酯脂肪酶和單�；视椭久傅�)對其核心脂質(zhì)進(jìn)行分解。最近的研究證實(shí),自噬介導(dǎo)的溶酶體內(nèi)降解也是脂滴分解的重要途徑。尤其是在動(dòng)脈粥樣硬化這個(gè)高脂環(huán)境中,自噬介導(dǎo)的脂滴分解可能較傳統(tǒng)的胞漿分解途徑起著更為重要的作用。更為直接的證據(jù)是在巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中,自噬通過溶酶體酸性脂肪酶調(diào)節(jié)膽固醇外流。抑制自噬會(huì)增加而誘導(dǎo)自噬會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的聚集。但是,目前少有研究報(bào)道自噬在VSMC泡沫樣變過程中的作用。瞬時(shí)受體電位香草醛亞家族1(transient receptor potential vanilloid subfamily 1,TRPV1)可被辣椒素激活。TRPV1是非選擇性陽離子通道并且對心腦血管疾病具有保護(hù)作用。以往研究顯示TRPV1的激活可以通過減少脂質(zhì)的攝取和增加脂質(zhì)的轉(zhuǎn)出而抑制VSMC泡沫樣變。最近研究表明TRPV1的激活可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的自噬水平。此外,TRPV1的激活以后可以進(jìn)一步促進(jìn)腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化,而后者在自噬的調(diào)控中發(fā)揮促進(jìn)作用。我們設(shè)想,TRPV1的激活可以通過促進(jìn)AMPK的磷酸化而誘導(dǎo)自噬,進(jìn)而抑制VSMC的泡沫樣變。為了證實(shí)我們的假設(shè),本研究分為三部分。第一部分探討自噬在VSMC泡沫樣變過程中的作用。利用氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlow-densitylipoprotein,oxldl)誘導(dǎo)原代vsmc泡沫樣變。利用雷帕霉素(rapamycin,rap)誘導(dǎo)自噬和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-ma)抑制自噬,探討調(diào)控自噬對vsmc泡沫樣變的作用。第二部分分題一在oxldl誘導(dǎo)的vsmc泡沫樣變模型中加入不同濃度的trpv1激動(dòng)劑辣椒素以及利用野生型和trpv1敲除的vsmc,探索激活trpv1對自噬的作用。分題二離體實(shí)驗(yàn)利用野生型和trpv1敲除的vsmc,在體實(shí)驗(yàn)利用野生型和trpv1敲除小鼠喂高脂以及辣椒素,探討激活trpv1對自噬溶酶體途徑的作用。分題三利用小干擾rna技術(shù),敲低自噬關(guān)鍵基因atg7,探討自噬在trpv1抑制vsmc泡沫樣變中的作用。第三部分研究trpv1激活誘導(dǎo)自噬的可能分子機(jī)制。利用野生型和trpv1敲除的vsmc,oxldl誘導(dǎo)泡沫樣變,利用ampk抑制劑compoundc,探討激活trpv1是否通過活化ampk通路而誘導(dǎo)自噬。材料與方法:離體實(shí)驗(yàn)主要利用c57bl/6j野生型和trpv1-/-小鼠的主動(dòng)脈原代培養(yǎng)的vsmc作為研究對象。在體實(shí)驗(yàn)分別利用c57bl/6j野生型和trpv1-/-小鼠隨機(jī)分為普高脂組(hfd組)和高脂加辣椒素組(hfd+cap組)。1.利用組織貼塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)vsmc。2.利用oxldl刺激vsmc構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型。3.采用蛋白免疫印跡的分子生物學(xué)技術(shù),探討自噬相關(guān)蛋白lc3、beclin-1及p62的變化以判斷自噬水平。4.采用油紅o染色檢測泡沫細(xì)胞形成,細(xì)胞內(nèi)膽固醇檢測分析細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。5.利用c57bl/6j野生型和trpv1-/-小鼠的主動(dòng)脈進(jìn)行原代平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng),以trpv1激動(dòng)劑辣椒素及其特異性拮抗劑作為藥物干預(yù)手段,采用蛋白免疫印跡法檢測主動(dòng)脈及平滑肌細(xì)胞上溶酶體相關(guān)蛋白lamp1的變化,采用免疫熒光的方法檢測lamp1的表達(dá)。6.利用轉(zhuǎn)染sirna技術(shù),敲低自噬關(guān)鍵蛋白atg7。7.利用ampk的抑制劑抑制ampk的活性,檢測atg7及l(fā)c3的表達(dá)。結(jié)果:1.oxldl呈濃度梯度地誘導(dǎo)vsmc脂質(zhì)聚集,80μg/ml最明顯;80μg/mloxldl呈時(shí)間依賴性地降低lc3ii/lc3i的比值、beclin-1的蛋白水平以及升高p62的蛋白水平,刺激24小時(shí)后變化最明顯。2.自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可以減少油紅O陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)和細(xì)胞內(nèi)總膽固醇的含量,而自噬抑制劑則增加油紅O陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)和細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。3.TRPV1激動(dòng)劑可呈濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)ox LDL降低的LC3II/LC3I的比值和beclin-1的蛋白水平,該作用可被TRPV1拮抗劑或TRPV1-/-所抑制。4.激活TRPV1可增加LAMP1的表達(dá),TRPV1的特異性拮抗劑及TRPV1-/-則不能增加LAMP1的表達(dá)。5.激活TRPV1可顯著升高高脂喂養(yǎng)野生型小鼠主動(dòng)脈LAMP1的表達(dá),而對高脂喂養(yǎng)TRPV1-/-小鼠LAMP1的表達(dá)沒有影響。6.在con si RNA轉(zhuǎn)染的VSMC,TRPV1激動(dòng)劑可以升高LC3II/LC3I的比值、beclin-1的蛋白水平以及減少油紅O染色陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量,而對Atg7 siRNA轉(zhuǎn)染的VSMC,TRPV1激動(dòng)劑則沒有顯示出上述效應(yīng)。7.激活TRPV1可增加p-AMPK的表達(dá),TRPV1的特異性拮抗劑及TRPV1-/-則不能增加p-AMPK的表達(dá);AMPK抑制劑compound C抑制p-AMPK、LC3II/LC3I的比值以及Atg7的蛋白表達(dá)。結(jié)論:本研究顯示在ox LDL誘導(dǎo)的VSMC泡沫樣變過程自噬水平是受到抑制的;調(diào)控自噬可以調(diào)節(jié)VSMC的泡沫樣變;TRPV1的激活可以通過誘導(dǎo)AMPK磷酸化而逆轉(zhuǎn)ox LDL抑制的自噬,從而抑制VSMC泡沫細(xì)胞形成。因此,本研究闡明了自噬在VSMC泡沫樣變中的作用并突出了TRPV1作為動(dòng)脈粥樣硬化防治的潛在靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：腺苷酸活化蛋白激酶 自噬 泡沫細(xì)胞 瞬時(shí)受體電位香草醛亞家族1 血管平滑肌細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R543.5
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-17
• 第二章 自噬在血管平滑肌細(xì)胞泡沫化過程中的作用17-47
• 分題一 體外血管平滑肌細(xì)胞泡沫化模型的構(gòu)建17-32
• 2.1.1 材料與方法17-26
• 2.1.2 結(jié)果26-30
• 2.1.3 討論30-32
• 分題二 自噬在血管平滑肌細(xì)胞泡沫化過程的作用32-46
• 2.2.1 材料與方法32-37
• 2.2.2 結(jié)果37-44
• 2.2.3 討論44-46
• 全章小結(jié)46-47
• 第三章 自噬介導(dǎo)TRPV1調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞泡沫化的作用47-79
• 分題一TRPV1激活對血管平滑肌細(xì)胞自噬的作用47-60
• 3.1.1 材料與方法48-52
• 3.1.2 結(jié)果52-58
• 3.1.3 討論58-60
• 分題二TRPV1激活對血管平滑肌細(xì)胞自噬溶酶體途徑的作用60-70
• 3.2.1 材料與方法60-64
• 3.2.2 結(jié)果64-69
• 3.2.3 討論69-70
• 分題三 自噬介導(dǎo)TRPV1調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞泡沫化的作用70-77
• 3.3.1 材料與方法70-72
• 3.3.2 結(jié)果72-76
• 3.3.3 討論76-77
• 全章小結(jié)77-79
• 第四章 激活TRPV1誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞自噬的分子機(jī)制79-89
• 4.1 材料與方法79-82
• 4.2 結(jié)果82-86
• 4.3 討論86-88
• 全章小結(jié)88-89
• 全文結(jié)論89-90
• 參考文獻(xiàn)90-97
• 文獻(xiàn)綜述 血管平滑肌細(xì)胞自噬與血管疾病研究進(jìn)展97-114
• 參考文獻(xiàn)106-114
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果114-116
• 致謝116

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李文生,宋志堅(jiān),趙淑民,羅寶國,陳麗璉,左煥琛;骨橋蛋白和骨連結(jié)蛋白在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)及與鈣化的關(guān)系[J];解剖學(xué)雜志;2002年01期

2 李華順;;AMPK和mTOR的自噬姻緣[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2011年03期

  本文關(guān)鍵詞：激活TRPV1誘導(dǎo)自噬在血管平滑肌細(xì)胞泡沫化中作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：447670