發(fā)布時(shí)間：2017-06-13 18:00

  本文關(guān)鍵詞：高壓氧聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、培養(yǎng)與鑒定目的：研究由人臍帶華通膠組織(Wharton's jelly)在體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞((umbilical cord derived mesenchymal stem cells,簡(jiǎn)稱HUCMSCs)的方法,并進(jìn)行HUCMSCs的各項(xiàng)鑒定。方法：臍帶華通膠組織采用膠原酶以及胰酶序貫消化法分離得到HUCMSCs,用流式細(xì)胞儀等分析其表型特征,向成骨、成脂以及成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化并鑒定。結(jié)果：由人臍帶華通膠可以有效獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。原代細(xì)胞培養(yǎng)24-48 h內(nèi)細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng),5-7 d左右可以傳代培養(yǎng),在2-3周時(shí)間內(nèi)可以迅速擴(kuò)增至10'到108數(shù)量級(jí)。各項(xiàng)分化鑒定試驗(yàn)證實(shí)HUCMSCs具有多向分化潛能,向成骨、成脂以及成軟骨細(xì)胞。HUCMSCs在體外培養(yǎng)傳至20-30代仍保持穩(wěn)定的細(xì)胞表面標(biāo)記。結(jié)論：由人臍帶華通膠可以有效地獲得間充質(zhì)干細(xì)胞,這種HUCMSCs能在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng),生物學(xué)特性穩(wěn)定,具有多向分化的潛能,是今后細(xì)胞治療很有前景的種子細(xì)胞。第二部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化研究目的：探討誘導(dǎo)HUCMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法,并對(duì)HUCMSCs轉(zhuǎn)分化而來(lái)的神經(jīng)干細(xì)胞(HUCMSCs-NSCs)進(jìn)行形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和功能學(xué)鑒定,為NSCs臨床移植治療SCI的研究提供細(xì)胞來(lái)源。方法：用表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor, EGF)和N2對(duì)HUCMSCs進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)；比較預(yù)誘導(dǎo)和未經(jīng)誘導(dǎo)的HUCMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化的效率。然后用人成纖維生長(zhǎng)因子-2(Human basic fibroblast growth factor-2, FGF2),表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)將預(yù)誘導(dǎo)后的HUCMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化。然后用免疫熒光化學(xué)、western blot對(duì)HUCMSCs-NSCs進(jìn)行組織學(xué)鑒定。結(jié)果：通過(guò)本實(shí)驗(yàn)方案成功將HUCMSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞,經(jīng)過(guò)預(yù)誘導(dǎo)后的HUCMSCs分化為神經(jīng)干細(xì)胞的效率明顯提高,首先,nestin的表達(dá)在預(yù)誘導(dǎo)后HUCMSCs顯著高于未誘導(dǎo)的HUCMSCs(P0.001);其次,在誘導(dǎo)后15d,比較神經(jīng)球的直徑大小(P0.001)和神經(jīng)球的nestin陽(yáng)性率(P0.001),在預(yù)誘導(dǎo)后HUCMSCs和未誘導(dǎo)的HUCMSCs之間比較,差異有顯著性。所有免疫組織化學(xué)結(jié)果均經(jīng)過(guò)Western blot驗(yàn)證。HUCMSCs-NSCs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物nestin。結(jié)論：通過(guò)本實(shí)驗(yàn)成功建立了誘導(dǎo)HUCMSCs向NSCs分化的方案,HUCMSCs-NSCs具備大部分神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)源NSCs的典型特征,為NSCs用于臨床移植治療SCI解決了來(lái)源問(wèn)題。但HUCMSCs-NSCs與中樞神經(jīng)來(lái)源的NSCs尚存在一定差別,當(dāng)前的方案仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。誘導(dǎo)；比較預(yù)誘導(dǎo)和未經(jīng)誘導(dǎo)的HUCMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化的效率。然后用人成纖維生長(zhǎng)因子-2(Human basic fibroblast growth factor-2, FGF2),表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)將預(yù)誘導(dǎo)后的HUCMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化。然后用免疫熒光化學(xué)、western blot對(duì)HUCMSCs-NSCs進(jìn)行組織學(xué)鑒定。結(jié)果：通過(guò)本實(shí)驗(yàn)方案成功將HUCMSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞,經(jīng)過(guò)預(yù)誘導(dǎo)后的HUCMSCs分化為神經(jīng)干細(xì)胞的效率明顯提高,首先,nestin的表達(dá)在預(yù)誘導(dǎo)后HUCMSCs顯著高于未誘導(dǎo)的HUCMSCs(P0.001);其次,在誘導(dǎo)后15d,比較神經(jīng)球的直徑大小(P0.001)和神經(jīng)球的nestin陽(yáng)性率(P0.001),在預(yù)誘導(dǎo)后HUCMSCs和未誘導(dǎo)的HUCMSCs之間比較,差異有顯著性。所有免疫組織化學(xué)結(jié)果均經(jīng)過(guò)Western blot驗(yàn)證。HUCMSCs-NSCs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物nestin。結(jié)論：通過(guò)本實(shí)驗(yàn)成功建立了誘導(dǎo)HUCMSCs向NSCs分化的方案,HUCMSCs-NSCs具備大部分神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)源NSCs的典型特征,為NSCs用于臨床移植治療SCI解決了來(lái)源問(wèn)題。但HUCMSCs-NSCs與中樞神經(jīng)來(lái)源的NSCs尚存在一定差別,當(dāng)前的方案仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。第三部分 高壓氧聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷目的：探討以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植同時(shí)應(yīng)用高壓氧治療大鼠脊髓損傷,觀察聯(lián)合作用對(duì)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。方法：SD大鼠80只,以鉗夾法制成脊髓損傷大鼠模型。隨機(jī)分成假手術(shù)對(duì)照組、假移植組、HUCMSCs移植組及HUCMSCs+HBOT移植組,每組20只。傷后第10天取材行MPO活性測(cè)定及ELISA檢測(cè)損傷局部炎癥因子,移植細(xì)胞后第28天行的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)、存活和分化檢測(cè)。造模后1,2,3,4周進(jìn)行BBB評(píng)分運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)。結(jié)果：高壓氧聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療組的療效最為顯著,運(yùn)動(dòng)學(xué)評(píng)分、炎癥因子表達(dá)降低程度、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量均優(yōu)于其他治療組。結(jié)論：高壓氧和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞兩種治療措施聯(lián)合能發(fā)揮協(xié)同作用,增強(qiáng)治療效果。第四部分高壓氧對(duì)大鼠脊髓損傷后巨噬細(xì)胞極化和神經(jīng)保護(hù)的影響目的：探討在脊髓損傷(SCI)后高壓氧治療(HBOT)的效果,尤其是側(cè)重于其對(duì)巨噬細(xì)胞活化和細(xì)胞凋亡的影響。方法：建立T10脊髓鉗夾損傷動(dòng)物模型。大鼠隨機(jī)分為三組：(A)假手術(shù)組,(B)SCI+常壓空氣組(NBA組；21%氧氣、1個(gè)絕對(duì)大氣壓,ATA),(C) SCI+短期高壓氧組(于手術(shù)后即行100%氧氣、2.8個(gè)絕對(duì)大氣壓的急性期治療,90分鐘/次,2次/天,共3天)。分別檢測(cè)三組模型的巨噬細(xì)胞活化、細(xì)胞凋亡、組織防護(hù)和功能恢復(fù)情況。結(jié)果：SCI環(huán)境下HBOT帶來(lái)顯著性變化,M2亞型的數(shù)量和水平顯著提升：(精氨酸酶-1(Arg-1)-陽(yáng)性),同時(shí)M1亞型的數(shù)量下降(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)-陽(yáng)性)。這與同步發(fā)生的髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性的衰減、細(xì)胞凋亡的抑制(原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)陽(yáng)性細(xì)胞,Caspase-3基因和Bax蛋白的表達(dá))和致炎因素(如白介素1β(IL-1β)?腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素17(IL-17))的下調(diào)有關(guān)。勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(LFB)和GAP-43染色結(jié)果顯示,高壓氧治療組的髓鞘形成和軸突再生的水平明顯高于常壓空氣組。這些變化與功能恢復(fù)的提升緊密相關(guān)。結(jié)論：高壓氧治療可以提升M2巨噬細(xì)胞活性,有效地減少脊髓損傷相關(guān)炎癥的發(fā)生,這可能會(huì)進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)并有助于大鼠脊髓損傷后的功能恢復(fù)。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 臍帶 華通膠 誘導(dǎo)分化能 臍帶間充質(zhì) 神經(jīng)干細(xì)胞 分化 脊髓損傷 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 移植 高壓氧 運(yùn)動(dòng)功能 脊髓損傷 高壓氧治療 繼發(fā)性損傷 巨噬細(xì)胞極化 凋亡 炎癥
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.2
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 第一部分 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、培養(yǎng)與鑒定13-38
• 引言13-14
• 材料和方法14-27
• 結(jié)果27-33
• 討論33-35
• 結(jié)論35
• 參考文獻(xiàn)35-38
• 第二部分 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化研究38-61
• 引言38-39
• 材料和方法39-47
• 結(jié)果47-56
• 討論56-58
• 結(jié)論58
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 第三部分 高壓氧聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷61-88
• 引言61-62
• 材料和方法62-75
• 結(jié)果75-79
• 討論79-83
• 結(jié)論83
• 參考文獻(xiàn)83-88
• 第四部分 高壓氧對(duì)大鼠脊髓損傷后巨噬細(xì)胞極化和神經(jīng)保護(hù)的影響88-97
• 引言88
• 材料和方法88-91
• 結(jié)果91-94
• 討論94-95
• 結(jié)論95-96
• 參考文獻(xiàn)96-97
• 綜述97-103
• 參考文獻(xiàn)100-103
• 發(fā)表論文103-104
• 致謝104

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 何紅燕;崔冰琳;馮學(xué)永;肖平;林曉波;蔣學(xué)武;羅敏潔;馬廉;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變[J];國(guó)際輸血及血液學(xué)雜志;2006年06期

2 KAM-SZE TSANG;;Induction of Functional Recovery by Co-transplantation of Neural Stem Cells and Schwann Cells in a Rat Spinal Cord Contusion Injury Model[J];Biomedical and Environmental Sciences;2007年03期

3 王金剛;尹忠民;聞華;;干細(xì)胞在腦性癱瘓治療中的應(yīng)用[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年23期

4 陳昱;練克儉;;繼發(fā)性脊髓損傷中細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生;2008年05期

5 胥少汀;脊髓原發(fā)和繼發(fā)損傷[J];中華骨科雜志;2005年09期

6 梁錦前;沈建雄;邱貴興;;干細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷的研究進(jìn)展[J];中國(guó)脊柱脊髓雜志;2008年06期

  本文關(guān)鍵詞：高壓氧聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：447164