本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)減輕氧化應(yīng)激損傷的新機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)(Neuronal Redox Homeostasis)是神經(jīng)元細胞內(nèi)抗氧化物和氧化物間一種相對含量。如果神經(jīng)元內(nèi)氧化物含量增加過多,可大量消耗抗氧化物,神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)可被打破,繼而引起神經(jīng)元細胞發(fā)生氧化損傷和凋亡。因此,維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)對減輕氧化應(yīng)激損傷意義重大。氧化應(yīng)激損傷是導致多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要原因,包括阿爾茲海默病(Alzheimer’disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和缺血性腦卒中(Ischemic Stroke)。氧化應(yīng)激損傷可引起神經(jīng)元細胞凋亡和小膠質(zhì)細胞過度激活,繼而可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)功能損害。使用抗氧化劑是減輕氧化應(yīng)激損傷的有效手段。我國有使用天然抗氧化劑的傳統(tǒng),早在公元前,中國人就有飲用綠茶(含天然抗氧化劑茶多酚)的記載。然而,遺憾的是,被認為具有較強抗氧化作用的常見抗氧化劑,如茶多酚、維生素C、維生素E和β-胡蘿卜素等,其大樣本多中心臨床試驗結(jié)果均為陰性�？寡趸瘬p傷機制不清是其重要因素之一。研究表明,天然大麻素四氫大麻酚(Tetrahydrocannabinol,THC)和人工合成大麻素(WIN55212-2)可通過減輕氧化應(yīng)激損傷,產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。但由于THC具有較強的成癮性,而WIN55212-2長期使用所導致的神經(jīng)精神癥狀,大大限制了其臨床應(yīng)用。Anandamide(AEA)是一種內(nèi)源性大麻素,可通過激活大麻素受體產(chǎn)生神經(jīng)保護作用,但AEA是否可減輕氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)元損傷,其抗氧化損傷機制如何,目前尚不清楚。阿米福汀(Amifostine)是一種臨床常用的抗放療損傷藥物,目前用于減輕X射線和化療藥物對惡性腫瘤病人正常組織的損傷。在外周組織的研究中發(fā)現(xiàn),阿米福汀具有抗氧化應(yīng)激損傷作用,但阿米福汀是否可通過維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)發(fā)揮抗氧化作用,目前未見報道。本研究旨在通過觀察AEA和阿米福汀的神經(jīng)保護作用,從維持神經(jīng)元細胞還原穩(wěn)態(tài)角度,分別探討其保護機制。第一部分大麻素AEA的抗氧化神經(jīng)保護機制實驗一尋找適宜AEA保護濃度并觀察AEA對神經(jīng)元CB1受體表達的影響目的:尋找適宜AEA細胞保護濃度并觀察其對神經(jīng)元CB1受體表達的影響。方法:我們將HT22小鼠海馬神經(jīng)元細胞系暴露于含H2O2的DMEM培養(yǎng)基,模擬氧化應(yīng)激損傷。為確定AEA適宜濃度,我們將HT22細胞分為6組,分別為正常培養(yǎng)的對照組(Control)、200μM H2O2損傷組和不同濃度AEA(1、5、10和20μM)的保護組。孵育3 h后,根據(jù)MTT值,確定適宜AEA濃度。隨后,將細胞分為5組,分別為Control組、H2O2損傷組、AEA保護組、CB1拮抗劑AM251干預組和AM251單獨使用組,采用Western blot和免疫細胞化學法觀察細胞CB1受體表達情況。結(jié)果:與H2O2損傷組相比,10μM和20μM的AEA可顯著提高細胞活力(P0.05)。此外,AEA可顯著上調(diào)HT22細胞CB1受體表達(P0.05),CB1拮抗劑AM251逆轉(zhuǎn)了AEA對CB1表達的上調(diào)作用(P0.05)。結(jié)論:我們選取10μM的AEA進行后續(xù)試驗,并且觀察到AEA可上調(diào)HT22細胞CB1受體表達。實驗二AEA通過CB1受體維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)目的:探討大麻素CB1受體在AEA維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)中的作用。方法:將細胞分為5組,分別為Control組、H2O2損傷組、AEA保護組、CB1拮抗劑AM251干預組和AM251單獨使用組。孵育3 h后,通過分析細胞活力、乳酸脫氫酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)釋放量、細胞形態(tài)和細胞凋亡率,評價細胞損傷程度;通過相應(yīng)試劑盒檢測細胞內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(Oxidized Glutathione,GSSG)含量,評價細胞內(nèi)抗氧化物和氧化物水平。隨后,使用CB1-si RNA,觀察其對AEA保護作用的影響。此外,我們還使用大鼠右側(cè)中腦動脈閉塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO),通過在體動物實驗,驗證了AEA的神經(jīng)保護作用。結(jié)果:AEA減輕了H2O2對HT22細胞的損傷,并降低了細胞凋亡,增加了細胞內(nèi)抗氧化物SOD和GSH水平,降低了氧化物ROS和GSSG含量(P0.05),AEA產(chǎn)生的上述作用被CB1拮抗劑或CB1-si RNA顯著逆轉(zhuǎn)(P0.05)。AEA對腦缺血大鼠產(chǎn)生的腦保護作用,也被CB1拮抗劑AM251逆轉(zhuǎn)(P0.05)。結(jié)論:AEA通過CB1受體,維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)并發(fā)揮神經(jīng)保護作用。實驗三NADPH氧化酶2在AEA產(chǎn)生抗氧化作用中的機制目的:探索NODPH氧化酶2(Nox2)在AEA產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激中的作用。方法:用Western blot和Real-Time PCR檢測AEA對Nox2蛋白表達和基因轉(zhuǎn)錄的影響。隨后,將HT22細胞分為5組,分別為Control組、H2O2損傷組、AEA保護組、Nox抑制劑Apocynin干預組和Apocynin單獨給藥組,通過Western blot檢測Nox2表達,MTT和LDH釋放量評價細胞損傷水平。結(jié)果:與Control組相比,H2O2可顯著上調(diào)HT22細胞Nox2蛋白表達和基因轉(zhuǎn)錄水平(P0.05),AEA下調(diào)了Nox2的基因表達和蛋白轉(zhuǎn)錄水平(P0.05),CB1拮抗劑AM251或CB1-si RNA顯著逆轉(zhuǎn)了AEA的上述作用(P0.05)。此外,我們發(fā)現(xiàn)Nox抑制劑未對AEA產(chǎn)生的細胞保護作用和抑制Nox2蛋白表達作用產(chǎn)生顯著影響(P0.05)。結(jié)論:Nox2介導了AEA對HT22細胞產(chǎn)生的抗氧化應(yīng)激作用。第二部分細胞保護劑阿米福汀維持PC12細胞還原穩(wěn)態(tài)的機制目的:探索細胞保護劑阿米福汀(Amifostine,Ami)的抗氧化神經(jīng)保護機制。方法:將PC12細胞暴露于含有高濃度谷氨酸(Glutamate,Glu)的培養(yǎng)基中,模擬神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷。隨后,將PC12細胞分為6組,分別為正常培養(yǎng)的Control組、Ami單獨處理組、Glu損傷組、Ami保護組、超氧化物歧化酶2干擾RNA(SOD2-si RNA)干預組和亂序RNA(SC-si RNA)干預組,孵育24 h后,通過免疫細胞化學和Western blot檢測細胞SOD2蛋白表達水平;采用MTT、LDH釋放量、細胞形態(tài)和凋亡率,評價細胞損傷水平。與此同時,檢測細胞線粒體內(nèi)超氧化物、細胞內(nèi)ROS、GSH和過氧化氫酶(Catalase,CAT)水平。結(jié)果:與Control組相比,谷氨酸可下調(diào)PC12細胞SOD2蛋白表達,損傷細胞,增加線粒體內(nèi)超氧化物和細胞質(zhì)內(nèi)ROS水平,并消耗細胞內(nèi)GSH和CAT(P0.05)。阿米福汀可減輕細胞損傷程度,上調(diào)SOD2表達,降低PC12細胞損傷,下調(diào)細胞線粒體超氧化物和ROS水平,增加GSH和CAT含量(P0.05)。SOD2-si RNA顯著逆轉(zhuǎn)了阿米福汀產(chǎn)生的上述細胞保護和抗氧化應(yīng)激損傷作用(P0.05),而SC-si RNA未對阿米福汀產(chǎn)生的上述作用造成顯著影響(P0.05)。結(jié)論:阿米福汀在SOD2介導下,通過維持細胞還原穩(wěn)態(tài),發(fā)揮神經(jīng)保護作用。小結(jié):大麻素AEA在CB1受體介導下,通過抑制神經(jīng)元Nox2蛋白表達和維持細胞還原穩(wěn)態(tài),發(fā)揮神經(jīng)保護作用。細胞保護劑阿米福汀通過上調(diào)SOD2表達,維持PC12細胞還原穩(wěn)態(tài),發(fā)揮神經(jīng)保護作用。氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)失衡,是引起CNS氧化損傷的重要原因。本研究為治療CNS氧化應(yīng)激損傷相關(guān)疾病,提供了可能的新選擇,也為維持神經(jīng)細胞還原穩(wěn)態(tài),提供了新機制。
【關(guān)鍵詞】：大麻素 阿米福汀 還原穩(wěn)態(tài) Nox2 SOD2
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R614
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• ABSTRACT11-17
• 前言17-19
• 文獻回顧19-35
• 一、氧化應(yīng)激損傷對 CNS 的危害19-23
• 二、抗氧化劑的神經(jīng)保護作用研究進展23-25
• 三、內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)與 CNS 疾病25-28
• 四、NADPH 氧化酶在 CNS 中的作用28-33
• 五、阿米福汀的研究和使用現(xiàn)狀33-35
• 第一部分 大麻素AEA的抗氧化神經(jīng)保護機制35-73
• 實驗一 尋找適宜AEA保護濃度并觀察AEA對神經(jīng)元CB1受體表達的影響35-45
• 1 材料36-37
• 2 方法37-40
• 3 結(jié)果40-42
• 4 討論42-45
• 實驗二 AEA通過CB1受體維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)45-63
• 1 材料45-47
• 2 方法47-53
• 3 結(jié)果53-60
• 4 討論60-63
• 實驗三 NADPH氧化酶2在AEA產(chǎn)生抗氧化作用中的機制63-73
• 1 材料63-65
• 2 方法65-66
• 3 結(jié)果66-70
• 4 討論70-73
• 第二部分 細胞保護劑阿米福汀維持PC12細胞還原穩(wěn)態(tài)的機制73-90
• 1 材料74-76
• 2 方法76-79
• 3 結(jié)果79-87
• 4 討論87-90
• 小結(jié)90-91
• 參考文獻91-102
• 附錄102-103
• 個人簡歷和研究成果103-105
• 致謝105

  本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)減輕氧化應(yīng)激損傷的新機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：429197