本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)減輕氧化應(yīng)激損傷的新機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)(Neuronal Redox Homeostasis)是神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)抗氧化物和氧化物間一種相對含量。如果神經(jīng)元內(nèi)氧化物含量增加過多,可大量消耗抗氧化物,神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)可被打破,繼而引起神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生氧化損傷和凋亡。因此,維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)對減輕氧化應(yīng)激損傷意義重大。氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要原因,包括阿爾茲海默病(Alzheimer’disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和缺血性腦卒中(Ischemic Stroke)。氧化應(yīng)激損傷可引起神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活,繼而可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)功能損害。使用抗氧化劑是減輕氧化應(yīng)激損傷的有效手段。我國有使用天然抗氧化劑的傳統(tǒng),早在公元前,中國人就有飲用綠茶(含天然抗氧化劑茶多酚)的記載。然而,遺憾的是,被認(rèn)為具有較強(qiáng)抗氧化作用的常見抗氧化劑,如茶多酚、維生素C、維生素E和β-胡蘿卜素等,其大樣本多中心臨床試驗(yàn)結(jié)果均為陰性�？寡趸瘬p傷機(jī)制不清是其重要因素之一。研究表明,天然大麻素四氫大麻酚(Tetrahydrocannabinol,THC)和人工合成大麻素(WIN55212-2)可通過減輕氧化應(yīng)激損傷,產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。但由于THC具有較強(qiáng)的成癮性,而WIN55212-2長期使用所導(dǎo)致的神經(jīng)精神癥狀,大大限制了其臨床應(yīng)用。Anandamide(AEA)是一種內(nèi)源性大麻素,可通過激活大麻素受體產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用,但AEA是否可減輕氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)元損傷,其抗氧化損傷機(jī)制如何,目前尚不清楚。阿米福汀(Amifostine)是一種臨床常用的抗放療損傷藥物,目前用于減輕X射線和化療藥物對惡性腫瘤病人正常組織的損傷。在外周組織的研究中發(fā)現(xiàn),阿米福汀具有抗氧化應(yīng)激損傷作用,但阿米福汀是否可通過維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)發(fā)揮抗氧化作用,目前未見報(bào)道。本研究旨在通過觀察AEA和阿米福汀的神經(jīng)保護(hù)作用,從維持神經(jīng)元細(xì)胞還原穩(wěn)態(tài)角度,分別探討其保護(hù)機(jī)制。第一部分大麻素AEA的抗氧化神經(jīng)保護(hù)機(jī)制實(shí)驗(yàn)一尋找適宜AEA保護(hù)濃度并觀察AEA對神經(jīng)元CB1受體表達(dá)的影響目的:尋找適宜AEA細(xì)胞保護(hù)濃度并觀察其對神經(jīng)元CB1受體表達(dá)的影響。方法:我們將HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系暴露于含H2O2的DMEM培養(yǎng)基,模擬氧化應(yīng)激損傷。為確定AEA適宜濃度,我們將HT22細(xì)胞分為6組,分別為正常培養(yǎng)的對照組(Control)、200μM H2O2損傷組和不同濃度AEA(1、5、10和20μM)的保護(hù)組。孵育3 h后,根據(jù)MTT值,確定適宜AEA濃度。隨后,將細(xì)胞分為5組,分別為Control組、H2O2損傷組、AEA保護(hù)組、CB1拮抗劑AM251干預(yù)組和AM251單獨(dú)使用組,采用Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察細(xì)胞CB1受體表達(dá)情況。結(jié)果:與H2O2損傷組相比,10μM和20μM的AEA可顯著提高細(xì)胞活力(P0.05)。此外,AEA可顯著上調(diào)HT22細(xì)胞CB1受體表達(dá)(P0.05),CB1拮抗劑AM251逆轉(zhuǎn)了AEA對CB1表達(dá)的上調(diào)作用(P0.05)。結(jié)論:我們選取10μM的AEA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),并且觀察到AEA可上調(diào)HT22細(xì)胞CB1受體表達(dá)。實(shí)驗(yàn)二AEA通過CB1受體維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)目的:探討大麻素CB1受體在AEA維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)中的作用。方法:將細(xì)胞分為5組,分別為Control組、H2O2損傷組、AEA保護(hù)組、CB1拮抗劑AM251干預(yù)組和AM251單獨(dú)使用組。孵育3 h后,通過分析細(xì)胞活力、乳酸脫氫酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)釋放量、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞凋亡率,評價(jià)細(xì)胞損傷程度;通過相應(yīng)試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(Oxidized Glutathione,GSSG)含量,評價(jià)細(xì)胞內(nèi)抗氧化物和氧化物水平。隨后,使用CB1-si RNA,觀察其對AEA保護(hù)作用的影響。此外,我們還使用大鼠右側(cè)中腦動脈閉塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO),通過在體動物實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了AEA的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果:AEA減輕了H2O2對HT22細(xì)胞的損傷,并降低了細(xì)胞凋亡,增加了細(xì)胞內(nèi)抗氧化物SOD和GSH水平,降低了氧化物ROS和GSSG含量(P0.05),AEA產(chǎn)生的上述作用被CB1拮抗劑或CB1-si RNA顯著逆轉(zhuǎn)(P0.05)。AEA對腦缺血大鼠產(chǎn)生的腦保護(hù)作用,也被CB1拮抗劑AM251逆轉(zhuǎn)(P0.05)。結(jié)論:AEA通過CB1受體,維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)三NADPH氧化酶2在AEA產(chǎn)生抗氧化作用中的機(jī)制目的:探索NODPH氧化酶2(Nox2)在AEA產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激中的作用。方法:用Western blot和Real-Time PCR檢測AEA對Nox2蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄的影響。隨后,將HT22細(xì)胞分為5組,分別為Control組、H2O2損傷組、AEA保護(hù)組、Nox抑制劑Apocynin干預(yù)組和Apocynin單獨(dú)給藥組,通過Western blot檢測Nox2表達(dá),MTT和LDH釋放量評價(jià)細(xì)胞損傷水平。結(jié)果:與Control組相比,H2O2可顯著上調(diào)HT22細(xì)胞Nox2蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄水平(P0.05),AEA下調(diào)了Nox2的基因表達(dá)和蛋白轉(zhuǎn)錄水平(P0.05),CB1拮抗劑AM251或CB1-si RNA顯著逆轉(zhuǎn)了AEA的上述作用(P0.05)。此外,我們發(fā)現(xiàn)Nox抑制劑未對AEA產(chǎn)生的細(xì)胞保護(hù)作用和抑制Nox2蛋白表達(dá)作用產(chǎn)生顯著影響(P0.05)。結(jié)論:Nox2介導(dǎo)了AEA對HT22細(xì)胞產(chǎn)生的抗氧化應(yīng)激作用。第二部分細(xì)胞保護(hù)劑阿米福汀維持PC12細(xì)胞還原穩(wěn)態(tài)的機(jī)制目的:探索細(xì)胞保護(hù)劑阿米福汀(Amifostine,Ami)的抗氧化神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。方法:將PC12細(xì)胞暴露于含有高濃度谷氨酸(Glutamate,Glu)的培養(yǎng)基中,模擬神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷。隨后,將PC12細(xì)胞分為6組,分別為正常培養(yǎng)的Control組、Ami單獨(dú)處理組、Glu損傷組、Ami保護(hù)組、超氧化物歧化酶2干擾RNA(SOD2-si RNA)干預(yù)組和亂序RNA(SC-si RNA)干預(yù)組,孵育24 h后,通過免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測細(xì)胞SOD2蛋白表達(dá)水平;采用MTT、LDH釋放量、細(xì)胞形態(tài)和凋亡率,評價(jià)細(xì)胞損傷水平。與此同時,檢測細(xì)胞線粒體內(nèi)超氧化物、細(xì)胞內(nèi)ROS、GSH和過氧化氫酶(Catalase,CAT)水平。結(jié)果:與Control組相比,谷氨酸可下調(diào)PC12細(xì)胞SOD2蛋白表達(dá),損傷細(xì)胞,增加線粒體內(nèi)超氧化物和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ROS水平,并消耗細(xì)胞內(nèi)GSH和CAT(P0.05)。阿米福汀可減輕細(xì)胞損傷程度,上調(diào)SOD2表達(dá),降低PC12細(xì)胞損傷,下調(diào)細(xì)胞線粒體超氧化物和ROS水平,增加GSH和CAT含量(P0.05)。SOD2-si RNA顯著逆轉(zhuǎn)了阿米福汀產(chǎn)生的上述細(xì)胞保護(hù)和抗氧化應(yīng)激損傷作用(P0.05),而SC-si RNA未對阿米福汀產(chǎn)生的上述作用造成顯著影響(P0.05)。結(jié)論:阿米福汀在SOD2介導(dǎo)下,通過維持細(xì)胞還原穩(wěn)態(tài),發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。小結(jié):大麻素AEA在CB1受體介導(dǎo)下,通過抑制神經(jīng)元Nox2蛋白表達(dá)和維持細(xì)胞還原穩(wěn)態(tài),發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。細(xì)胞保護(hù)劑阿米福汀通過上調(diào)SOD2表達(dá),維持PC12細(xì)胞還原穩(wěn)態(tài),發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)失衡,是引起CNS氧化損傷的重要原因。本研究為治療CNS氧化應(yīng)激損傷相關(guān)疾病,提供了可能的新選擇,也為維持神經(jīng)細(xì)胞還原穩(wěn)態(tài),提供了新機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：大麻素 阿米福汀 還原穩(wěn)態(tài) Nox2 SOD2
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R614
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• ABSTRACT11-17
• 前言17-19
• 文獻(xiàn)回顧19-35
• 一、氧化應(yīng)激損傷對 CNS 的危害19-23
• 二、抗氧化劑的神經(jīng)保護(hù)作用研究進(jìn)展23-25
• 三、內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)與 CNS 疾病25-28
• 四、NADPH 氧化酶在 CNS 中的作用28-33
• 五、阿米福汀的研究和使用現(xiàn)狀33-35
• 第一部分 大麻素AEA的抗氧化神經(jīng)保護(hù)機(jī)制35-73
• 實(shí)驗(yàn)一 尋找適宜AEA保護(hù)濃度并觀察AEA對神經(jīng)元CB1受體表達(dá)的影響35-45
• 1 材料36-37
• 2 方法37-40
• 3 結(jié)果40-42
• 4 討論42-45
• 實(shí)驗(yàn)二 AEA通過CB1受體維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)45-63
• 1 材料45-47
• 2 方法47-53
• 3 結(jié)果53-60
• 4 討論60-63
• 實(shí)驗(yàn)三 NADPH氧化酶2在AEA產(chǎn)生抗氧化作用中的機(jī)制63-73
• 1 材料63-65
• 2 方法65-66
• 3 結(jié)果66-70
• 4 討論70-73
• 第二部分 細(xì)胞保護(hù)劑阿米福汀維持PC12細(xì)胞還原穩(wěn)態(tài)的機(jī)制73-90
• 1 材料74-76
• 2 方法76-79
• 3 結(jié)果79-87
• 4 討論87-90
• 小結(jié)90-91
• 參考文獻(xiàn)91-102
• 附錄102-103
• 個人簡歷和研究成果103-105
• 致謝105

  本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)減輕氧化應(yīng)激損傷的新機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：429196