發(fā)布時間：2017-06-05 05:00

  本文關(guān)鍵詞：杜鵑素舒張大鼠主動脈及對自發(fā)性高血壓大鼠主動脈損傷的保護作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：杜鵑素是中藥材滿山紅(興安杜鵑)的主要活性成分,對慢性支氣管炎具有明顯的治療作用,還具有抗菌、抗炎和免疫抑制等作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),杜鵑素對血管內(nèi)皮細胞的損傷有保護作用,還可明顯抑制血管平滑肌細胞增殖,提示杜鵑素在心血管系統(tǒng)疾病的治療中將具有重要意義。但杜鵑素是否對自發(fā)性高血壓大鼠具有降壓及對主動脈損傷是否有保護作用等均尚未見報道,因此,本課題研究杜鵑素對大鼠離體主動脈的舒張作用及其對自發(fā)性高血壓大鼠降壓和主動脈損傷保護的影響,并進一步探討杜鵑素對大鼠主動脈基因表達譜的影響。為杜鵑素在高血壓等心腦血管疾病防治中提供理論依據(jù)。本論文分為三個部分第一部分杜鵑素對大鼠離體主動脈血管環(huán)的舒張作用及其機制研究研究目的:通過離體血管環(huán)實驗系統(tǒng),觀察杜鵑素對大鼠離體主動脈的肌源性反應(yīng);利用激光共聚焦和全細胞膜片鉗實驗方法 ,初步探討杜鵑素對大鼠主動脈血管平滑肌細胞內(nèi)鈣離子濃度和平滑肌細胞L-型電壓依賴性鈣電流的影響。實驗方法:1.大鼠離體主動脈血管環(huán)肌源性實驗采用血管張力記錄儀,用60 m M KCl或1μM PE收縮主動脈,觀察杜鵑素對大鼠主動脈的舒張作用,探討一氧化氮、內(nèi)皮、細胞外氯化鈣的濃度和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上相關(guān)受體與杜鵑素對大鼠主動脈舒張作用的關(guān)系。2.激光共聚焦實驗測定大鼠主動脈平滑肌細胞內(nèi)鈣離子濃度將細胞用熒光染料Fluo-4-AM染色,依次用60 m M KCl,60 m M KCl+14.02μM杜鵑素,正常HEPES液,60 m M KCl灌流細胞,記錄各個條件細胞的熒光值。最終用相對熒光密度值來反應(yīng)細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化。3.電生理學(xué)實驗方法 采用全細胞膜片鉗技術(shù),記錄大鼠主動脈血管平滑肌細胞膜L-型電壓依賴性鈣電流,并觀察杜鵑素作用后的影響。實驗結(jié)果:1.杜鵑素對KCl或PE預(yù)收縮的大鼠主動脈血管環(huán)具有濃度依賴性舒張作用。100μM的杜鵑素對KCl或PE預(yù)收縮主動脈環(huán)的最大舒張百分比分別為66.97%和65.13%,其EC50值分別為14.02μM和35.94μM。該實驗表明,杜鵑素對KCl或PE預(yù)收縮的血管環(huán)舒張作用兩者間并沒有顯著差異。這種舒張血管作用并不受一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)或去內(nèi)皮的顯著影響。去內(nèi)皮主動脈在無Ca2+溶液中,預(yù)孵杜鵑素后,用KCl或PE誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上,氯化鈣量效曲線下移。此外,預(yù)孵維拉帕米后,杜鵑素可誘導(dǎo)舒張PE預(yù)收縮的去內(nèi)皮主動脈,并且這種作用可通過Ryanodine受體阻斷劑釕紅來增強,而IP3受體阻斷劑肝素無此作用。2.利用激光共聚焦實驗分析原代培養(yǎng)的大鼠主動脈血管平滑肌細胞內(nèi)鈣離子的變化。14.02μM杜鵑素使細胞內(nèi)的鈣離子熒光密度下降了72.9%,然后血管平滑肌細胞用60 m M KCl(去除杜鵑素)孵浴,KCl又引起細胞內(nèi)鈣離子的增加幾乎達到原來的水平,上述結(jié)果表明杜鵑素能降低原代培養(yǎng)的大鼠主動脈血管平滑肌細胞內(nèi)鈣離子的水平。3.膜片鉗電生理學(xué)實驗結(jié)果顯示,對原代培養(yǎng)的大鼠主動脈血管平滑肌細胞,LVGC最大電流密度為-10.72±0.45 p A/p F。在0 m V出現(xiàn)峰電流,14.02μM杜鵑素抑制LVGC峰電流的百分比為59.50%。表明杜鵑素對大鼠主動脈血管平滑肌細胞LVGC具有顯著的抑制作用。第二部分杜鵑素對自發(fā)性高血壓大鼠降壓作用和主動脈損傷的保護作用及其機制研究研究目的:研究杜鵑素對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用和主動脈損傷的保護作用,并用不同層次多項實驗指標,探討其作用機制。實驗方法:1.WKY和SHR血壓、心率和體重的測量8只12周齡的雄性WKY為正常大鼠對照組(WKY+C),24只12周齡的雄性SHR隨機分為SHR空白對照組(SHR+C),SHR杜鵑素治療組(SHR+F)和SHR維拉帕米陽性對照組(SHR+V)。采用灌胃法給藥,杜鵑素的給藥劑量為:50mg/(kg·d),維拉帕米的給藥劑量為:50 mg/(kg·d),對照組給予等量生理鹽水,治療時間為8周。采用尾動脈測壓方法每周測定大鼠血壓、心率和體重。2.大鼠血漿生化指標的測定按試劑盒說明,用分光光度計或酶標儀,檢測四組大鼠血漿中Ang II、ET-1、NO、NOS、SOD、MDA、IL-6和TNF-α含量或活性水平。3.大鼠主動脈勻漿細胞因子的測定按試劑盒說明或文獻報道方法,檢測四組大鼠主動脈組織勻漿中Nitrite、O2-、e NOS和NAD(P)H oxidase含量或活性水平。4.主動脈組織病理觀測取大鼠主動脈,用HE染色和Masson染色,Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量大鼠主動脈相關(guān)參數(shù)。5.免疫組織化學(xué)法或免疫熒光法測定主動脈蛋白的表達大鼠主動脈組織中Collagen I、Collagen III、MMP-2、MMP-9、ROS、NF-k B的表達。6.大鼠主動脈m RNA和蛋白的表達RT-PCR和Western blot法檢測各組大鼠主動脈e NOS、p22phox、NF-k B和SM-α-actin m RNA和蛋白的表達。實驗結(jié)果:1.藥物干預(yù)前,與同周齡WKY+C組比較,SHR+C組血壓明顯升高(p0.01)。用藥1周后,SHR+F組血壓無顯著變化;SHR+V組血壓明顯降低(p0.01)。用藥2周后,與SHR+C組比較,SHR+F組血壓開始緩慢下降,到20周時,血壓下降到158±5 mm Hg。藥物干預(yù)前,SHR+C組大鼠心率比WKY+C組高。實驗期間,WKY+C組大鼠心率平穩(wěn),基本維持在375 bpm左右;而SHR+C組基本維持在420 bpm左右。SHR+F組大鼠心率和SHR+C組比較無顯著性差異。整個實驗過程四個實驗組大鼠體重都呈現(xiàn)出增長趨勢。與SHR+C組比較,SHR+F組體重無顯著性差異。2.對Ang II、ET-1、MDA、IL-6和TNF-α在血漿中的含量或活性而言,SHR+C組顯著高于WKY+C組(p0.01)。用杜鵑素灌胃大鼠8周后,與SHR+C組比較,SHR+F組和SHR+V組血漿中Ang II、ET-1、MDA、IL-6和TNF-α的含量都明顯降低(p0.01);相反,對SOD、NO和NOS在血漿中的含量而言,SHR+C組顯著低于WKY+C組(p0.01)。杜鵑素灌胃大鼠8周后,與SHR+C組比較,SHR+F組和SHR+V組血漿中NO的含量明顯升高(p0.01),因此杜鵑素的降壓和保護血管損傷作用可能的機制之一是通過降低氧化應(yīng)激水平、調(diào)節(jié)免疫因子和舒張收縮血管因子來實現(xiàn)的。3.對e NOS在主動脈組織中的活性而言,SHR+C組顯著低于WKY+C組(p0.01)。杜鵑素灌胃大鼠8周后,與SHR+C組比較,SHR+F組主動脈組織中e NOS的活性明顯升高(p0.01),同樣SHR+V組主動脈組織中e NOS的活性也明顯升高(p0.05)。相反,對Nitrite、O2-、NADPH oxidase和NADH oxidase在主動脈組織中的含量或活性水平而言,SHR+C組均顯著高于WKY+C組(p0.05)。用杜鵑素灌胃大鼠8周后,與SHR+C組和SHR+V組比較,SHR+F組主動脈組織中Nitrite、O2-、NADPH oxidase和NADH oxidase的活性明顯降低(p0.05),因此進一步確證杜鵑素保護血管損傷的可能作用機制之一是降低氧化應(yīng)激水平。4.從HE和Masson染色結(jié)果看,SHR+F組和SHR+V組較SHR+C組,大鼠主動脈平滑肌細胞肥大、排列紊亂減輕,內(nèi)皮細胞排列較整齊,中膜厚度明顯減輕,細胞核面積減小,大鼠主動脈的膠原相對含量顯著降低(p0.05)。杜鵑素對自發(fā)性高血壓大鼠主動脈的損傷有保護作用,具體主要表現(xiàn)在降低主動脈中膜厚度、中膜厚度與內(nèi)徑比、血管壁厚度等。從免疫組化結(jié)果看,SHR+F組Collagen I、Collagen III、MMP-2、MMP-9和ROS的表達均顯著降低(p0.01),這可能與杜鵑素對自發(fā)性高血壓大鼠主動脈損傷的保護作用相關(guān)。5.與SHR+C組比較,SHR+F組大鼠主動脈e NOS m RNA和蛋白的表達顯著降低(p0.01),而p22 phox、NF-k B和SM-α-actin m RNA和蛋白的表達顯著升高(p0.01)。第三部分杜鵑素對自發(fā)性高血壓大鼠主動脈基因表達譜的影響研究目的:研究杜鵑素對自發(fā)性高血壓大鼠主動脈基因表達譜的影響,尋找最大差異表達基因及與高血壓相關(guān)的信號通路,為深入研究杜鵑素降血壓作用機制提供新思路。實驗方法：1.取大鼠主動脈組織,提取總RNA,純化m RNA,反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈c DNA。利用PCR線性擴增后,通過PAGE膠電泳純化,構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI Step One Plus Real-Time PCR System質(zhì)檢合格后,使用Illumina Hi Seq?2000進行測序。2.以WKY+C vs SHR+C作為對照,分析SHR+C vs SHR+F差異表達基因,對差異表達基因進行GO和Pathway分析并進行顯著性檢驗,對差異表達的關(guān)鍵基因進行驗證,從基因水平探討杜鵑素防治高血壓和保護主動脈損傷的作用機制。實驗結(jié)果:1.經(jīng)過分析,可知WKY+C vs SHR+C的主動脈差異表達的基因數(shù)為1991個,其中表達上調(diào)444個,表達下調(diào)1547個;SHR+C vs SHR+F的主動脈差異表達的基因數(shù)為2904個,其中表達上調(diào)2329個,表達下調(diào)575個;SHR+C vs SHR+V的主動脈差異表達的基因數(shù)為1666個,其中表達上調(diào)1037個,表達下調(diào)629個。2.基于高血壓因素,對WKY+C vs SHR+C、SHR+C vs SHR+F和SHR+C vs SHR+V的主動脈差異基因GO功能顯著性富集分析可知:按GO細胞組分,這些差異基因主要涉及:收縮纖維基因、肌原纖維基因、肌動蛋白細胞骨架基因、肌小節(jié)基因、收縮纖維組分基因;按分子功能,這些差異基因主要涉及的分子功能有:結(jié)合、蛋白結(jié)合、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性、氧化還原酶活性、細胞因子調(diào)控的蛋白激酶活性;按參與的生物過程差異基因,主要涉及的生物過程有:細胞過程、代謝過程、細胞代謝過程、肌肉系統(tǒng)過程、生物調(diào)控、肌肉收縮、小肌肉代謝過程、基于長絲肌動蛋白、橫紋肌收縮、壓力效應(yīng)、生物學(xué)過程的調(diào)控。3.通過Pathway顯著性富集分析,據(jù)WKY+C vs SHR+C、SHR+C vs SHR+F、SHR+C vs SHR+V三組數(shù)據(jù)和相關(guān)文獻報道,我們篩選出三組中7個與高血壓相關(guān)基因表達的共有信號通路,分別為:血管平滑肌收縮、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)控、絲裂原活化蛋白激酶信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、血管緊張素調(diào)控的水再吸收通路、腎素血管緊張素系統(tǒng)和鈣離子信號系統(tǒng)。4.為了進一步驗證WKY+C vs SHR+C、SHR+C vs SHR+F、SHR+C vs SHR+V的Vascular smooth muscle contraction信號通路中基因差異表達的準確性,我們選取了在通路中較為關(guān)鍵的10個基因:VOC、ADRA1、AGTR1、Ca M、MLCK、IP3R、PLC、MLC、Ca D和Actin,這些基因的RT-PCR實驗結(jié)果和二代測序技術(shù)的實驗結(jié)果趨勢基本吻合。5.在WKY+C vs SHR+C、SHR+C vs SHR+F和SHR+C vs SHR+V,我們對共表達的453個差異基因進行了聚類分析,同時據(jù)四組中基因差異表達倍數(shù)為4倍考慮,我們篩選了18個差異極大的基因。其中Adra1d基因不僅與高血壓有密切關(guān)系,而且在測序數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)Adra1d基因參與了Pathway顯著性富集的信號通路Vascular smooth muscle contraction。Adra1d基因在WKY+C vs SHR+C下調(diào)達9.74倍,而SHR+C vs SHR+F上調(diào)了7.95倍。結(jié)論:1.杜鵑素對大鼠離體主動脈具有顯著的舒張作用,其作用機制是抑制L-型電壓依賴性鈣通道、受體操縱性鈣通道和肌漿網(wǎng)上的Ryanodine受體,從而降低了大鼠主動脈血管平滑肌細胞內(nèi)鈣離子的含量。2.杜鵑素顯著地降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓且對主動脈的損傷有保護作用,其作用機制可能與調(diào)控氧化應(yīng)激水平、免疫因子和舒張收縮血管因子有關(guān)。3.基因表達譜研究初步表明,杜鵑素降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓和保護主動脈損傷可能與上調(diào)Vascular smooth muscle contraction通路中的Adra1d基因有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：杜鵑素 主動脈 血管舒張 動脈損傷 基因表達譜
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

• 中文摘要10-16
• 英文摘要16-25
• 常用縮寫詞中英文對照表25-27
• 前言27-29
• 第一部分 杜鵑素對大鼠離體主動脈血管環(huán)的舒張作用及其機制研究29-45
• 1. 材料和儀器29-31
• 1.1. 主要試劑29
• 1.2. 溶液的配制29-30
• 1.3. 實驗動物30
• 1.4. 實驗主要儀器30-31
• 2. 方法31-35
• 2.1. 血管環(huán)制備及血管反應(yīng)性的檢測31
• 2.2. 離體血管環(huán)肌源性反應(yīng)正式實驗31-33
• 2.3. VSMC的培養(yǎng)和鑒定33
• 2.4. 激光共聚焦實驗測定杜鵑素對大鼠主動脈血管平滑肌細胞內(nèi)鈣離子的影響33-34
• 2.5. 膜片鉗實驗測量杜鵑素對大鼠VSMC的L-型鈣電流的影響34
• 2.6. 統(tǒng)計方法34-35
• 3. 結(jié)果35-42
• 3.1. 靜息狀態(tài)下，杜鵑素對大鼠離體主動脈環(huán)張力的影響35
• 3.2. 杜鵑素對大鼠離體主動脈血管環(huán)的舒張作用35-36
• 3.3. 杜鵑素舒張大鼠離體主動脈血管環(huán)與內(nèi)皮的關(guān)系36-37
• 3.4. 杜鵑素對大鼠離體主動脈血管環(huán)Ca Cl2量效曲線的影響37-38
• 3.5. 鈣離子阻斷劑對杜鵑素舒張大鼠主動脈血管環(huán)的影響38-39
• 3.6. 大鼠主動脈血管平滑肌細胞純度的鑒定39-40
• 3.7. 杜鵑素對血管平滑肌細胞鈣離子水平的影響40-41
• 3.8. 杜鵑素對血管平滑肌細胞LVGC電流的影響41-42
• 4. 討論42-43
• 5. 結(jié)論43-45
• 第二部分 杜鵑素對SHR降壓作用和主動脈損傷的保護作用及其機制研究45-81
• 1. 材料和儀器45-47
• 1.1. 實驗動物45-46
• 1.2. 主要試劑46
• 1.3. 實驗儀器及分析軟件46-47
• 2. 方法47-55
• 2.1. 實驗動物分組及給藥47
• 2.2. 血壓、心率和體重的測量47-48
• 2.3. 大鼠血漿生化指標的測定48
• 2.4. 大鼠主動脈勻漿細胞因子的測定48
• 2.5. 大鼠主動脈組織病理學(xué)觀測48-49
• 2.6. 免疫組織化學(xué)測定主動脈相關(guān)蛋白的表達49-50
• 2.7. 主動脈血管m RNA的表達50-53
• 2.8. 主動脈血管蛋白的表達53-55
• 2.9. 統(tǒng)計方法55
• 3. 結(jié)果55-76
• 3.1. 實驗大鼠生長情況55
• 3.2. 杜鵑素對大鼠血壓、心率和體重的影響55-58
• 3.3. 杜鵑素對大鼠血漿生化指標的影響58-61
• 3.4. 杜鵑素對大鼠主動脈組織細胞因子的影響61-63
• 3.5. 杜鵑素對大鼠主動脈組織形態(tài)學(xué)的影響63-73
• 3.6. 杜鵑素對大鼠主動脈血管mRNA表達的影響73-75
• 3.7. 杜鵑素對大鼠主動脈血管蛋白的表達影響75-76
• 4. 討論76-80
• 5. 結(jié)論80-81
• 第三部分 杜鵑素對SHR主動脈基因表達譜的影響81-115
• 1. 材料和儀器81-82
• 1.1. 儀器設(shè)備81
• 1.2. 主要試劑81-82
• 2. 方法82-87
• 2.1. 動物分組與主動脈血管取材82
• 2.2. 實驗流程82-83
• 2.3. 信息分析流程83-86
• 2.4. 熒光定量RT-PCR實驗86-87
• 2.5. 統(tǒng)計方法87
• 3. 結(jié)果87-111
• 3.1. 測序質(zhì)量評估87-89
• 3.2. 測序飽和度分析89-91
• 3.3. Clean Tags拷貝數(shù)分布統(tǒng)計91-93
• 3.4. Clean Tags比對的結(jié)果統(tǒng)計93-96
• 3.5. 差異表達基因96-97
• 3.6. Gene Ontology功能顯著性分析97-99
• 3.7. Pathway顯著性富集分析99-108
• 3.8. 相關(guān)基因的驗證108-110
• 3.9. 差異最大基因分析110-111
• 4. 討論111-113
• 5. 結(jié)論113-115
• 主要結(jié)論115-116
• 展望116-117
• 參考文獻117-128
• 綜述128-153
• 1. 黃酮類化合物128-131
• 1.1. 黃酮類化合物簡介128-129
• 1.2. 黃酮類化合物的生物活性129-131
• 1.3. 黃酮類化合物的產(chǎn)品開發(fā)131
• 2. 高血壓131-139
• 2.1. 高血壓簡介131-132
• 2.2. 高血壓的發(fā)病機制132-133
• 2.3. 目前抗高血壓的藥物133-135
• 2.4. 高血壓基因治療135-139
• 3. 黃酮類化合物對高血壓防治作用研究139-144
• 3.1. 高血壓與血管平滑肌細胞139-141
• 3.2. 高血壓與內(nèi)皮細胞141-142
• 3.3. 黃酮類化合物對高血壓的防治作用142-144
• 參考文獻144-153
• 在學(xué)期間承擔/參與的科研課題與研究成果153-155
• 個人簡歷155-156
• 致謝156

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：杜鵑素舒張大鼠主動脈及對自發(fā)性高血壓大鼠主動脈損傷的保護作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：422929