發(fā)布時間：2017-06-04 23:16

  本文關(guān)鍵詞：苔類植物聯(lián)芐合成相關(guān)基因功能鑒定及催化機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：苔蘚植物是介于藻類和蕨類植物之間的一個非常重要的植物類群,可以分為苔綱、蘚綱和角苔綱。苔類植物富含萜類和芳香類化合物,化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣并具有多種多樣的生物活性,如抗真菌、細胞毒、昆蟲拒食、自由基清除等,因此苔類植物成為生物活性天然產(chǎn)物的寶庫。但是由于苔類植物本身的生長環(huán)境特殊、個體矮小且往往種間雜生,很難富集到大量的高純度的材料進行研究。分子生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展為解決該問題提供了一個途徑。前人通過同位素追蹤法提出了苔類植物中雙聯(lián)芐類化合物的生物合成途徑,但是對于催化其生物合成反應(yīng)的關(guān)鍵酶研究的還比較少,因此,尋找催化苔類植物次級代謝產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵酶,闡明重要次級代謝物的生物合成途徑,通過代謝工程手段提高天然活性產(chǎn)物的含量,是解決活性化合物來源的一個重要途徑。本研究通過篩選cDNA文庫EST測序以及轉(zhuǎn)錄組測序等方法得到了鈍鱗紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)和粗裂地錢(Marchantia paleacea)中聯(lián)芐類化合物生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因,并對其中幾個進行了詳細研究。包括苯丙烷代謝途徑的第一個關(guān)鍵酶苯丙氨酸裂解酶(L-phenylalanine ammonia-lyase,PAL),鑒定了其體外生化特征并對非生物脅迫條件下PAL的表達與聯(lián)芐含量的關(guān)系進行了初步探討；克隆了兩個細胞色素P450基因,對其基因結(jié)構(gòu)、表達特征進行了分析,發(fā)現(xiàn)其與聯(lián)芐生物合成具有一定的相關(guān)性；對苔類植物中克隆得到的兩類羧酸芪類合成酶(stilbenecarboxylate synthase, STCS) STCS1和STCS2的進行了體外酶活分析,對其底物選擇性進行了初步探討,并獲得了STCS1的蛋白晶體,收集到高分辨數(shù)據(jù),對其可能的選擇機制進行了初步闡述。主要研究內(nèi)容和結(jié)果包括：1.苔類植物聯(lián)芐合成途徑——苯丙烷代謝途徑的第一個關(guān)鍵酶,苯丙氨酸裂解酶(PAL)的克隆及功能研究從鈍鱗紫背苔cDNA文庫EST測序結(jié)果中得到一個注釋為苯丙氨酸裂解酶(PAL)的基因片段,通過5'RACE方法得到其全長cDNA序列,生物信息學(xué)分析顯示,與其他植物來源的PALs具有60-75%的同源性,具有Ala-Ser-Gly催化三聯(lián)體和其他保守活性氨基酸,同源建模模擬得到其三維結(jié)構(gòu)模型,與來自歐芹的PcPAL整體折疊和保守結(jié)構(gòu)域類似,這些分析表明其是一個苯丙氨酸裂解酶,命名為PaPAL。對其進化地位進行分析,結(jié)果表明PaPAL與蕨類、苔蘚類和裸子植物的PALs親緣關(guān)系比較近,與傳統(tǒng)的植物進化進程一致。另外,以基因組DNA為模板擴增得到基因序列,與cDNA序列比對發(fā)現(xiàn),基因編碼區(qū)只有一個外顯子,沒有內(nèi)含子。構(gòu)建PaPAL的原核表達載體并且轉(zhuǎn)入表達型大腸桿菌BL21(DE3)中進行蛋白的誘導(dǎo)表達。對純化后的蛋白進行體外酶活鑒定,結(jié)果顯示PaPAL能夠高效的催化L-苯丙氨酸生成肉桂酸,并能夠以L-酪氨酸為底物產(chǎn)生對羥基肉桂酸,是一個雙功能酶,但對兩種底物的催化效率有差別,酶學(xué)動力學(xué)分析表明L-苯丙氨酸是PaPAL的最適底物。此外,PaPAL的表達受到激素茉莉酸甲酯(MeJA)和脫落酸(ABA)的誘導(dǎo),而且激素誘導(dǎo)條件下葉狀體聯(lián)芐含量與PaPAL的表達有一定的正相關(guān)。2.查爾酮合成酶家族基因的克隆和功能研究通過對粗裂地錢在特定配子體階段轉(zhuǎn)錄組進行測序,得到一些標注為查爾酮合成酶基因的序列,選取其中4個克隆進行全長cDNA序列擴增,得到基因序列和數(shù)據(jù)庫中的MpSTCS1,2具有較高同源性,因此被命名為MPaSTCS1-4。對克隆得到的STCSs序列進行分析,它們與其他CHSs有很高的同源性,并具有保守的催化位點Cys-His-Asn及其他保守氨基酸,表明他們都屬于CHS超家族,可能具有查爾酮合成酶功能。構(gòu)建STCSs基因的原核表達體系,得到純化的蛋白并進行體外酶活檢測,發(fā)現(xiàn)這4個STCSs根據(jù)催化底物酶活效率的不同可以分為兩類。以二氫對羥基香豆酰輔酶A (dihydro-p-coumaroyl-CoA)為起始底物,它們都能夠發(fā)生C6/C1環(huán)化生成根皮素(phloretin)和內(nèi)酯化產(chǎn)物dihydro-4-coumaroyltriacetic acid lactone (dihydro-CTAL)和dihydrobisnoryangonin (dihydro-BNY)。但是以對羥基香豆酰輔酶A (p-coumaroyl-Co A)為起始底物時,MPaSTCS2能夠催化發(fā)生C6/C1環(huán)化生成柚皮素,而另外3個STCSs與STCS2催化效率相差很大,只能生成痕量的柚皮素(質(zhì)譜檢測到),主要產(chǎn)物是內(nèi)酯化的α-吡喃酮衍生物CTAL和BNY。這兩類STCSs對這兩種底物具有明顯的選擇性,但是現(xiàn)有的研究結(jié)果還無法解釋這種差異的來源,我們期望從結(jié)構(gòu)角度來解釋這種差異,并進一步闡明催化機制。我們選取MPaSTCS1進行進一步的晶體學(xué)研究。3.對STCS1蛋白的初步晶體學(xué)研究利用大腸桿菌系統(tǒng)進行STCS1表達,純化得到大量單一的STCS1蛋白,初步篩選得到微晶。然后優(yōu)化結(jié)晶條件,得到較大的晶體進行衍射實驗,獲得2.4A高分辨的衍射數(shù)據(jù),通過分子置換、模型修正等方法,得到STCS1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。STCS1的晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)功能二聚體形式,每個不對稱單位中含有六個STCS1分子。STCS1單體包含上下兩個結(jié)構(gòu)域,總體呈現(xiàn)出αβαβα假對稱模式,上下部分之間有一個裂縫,形成活性空腔。將其與同源蛋白MpSTCS2和MsCHS進行結(jié)構(gòu)比對,發(fā)現(xiàn)三者的三維結(jié)構(gòu)非常類似,僅在活性位點附近有細微的差別。將STCS1晶體結(jié)構(gòu)分別與底物和產(chǎn)物分子進行對接,分析與底物分子或產(chǎn)物分子相互作用的氨基酸殘基及作用特點,并與經(jīng)典的CHS和底物／產(chǎn)物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)進行比較,尋找STCS1與CHS催化活性位點的差別,從結(jié)構(gòu)角度解釋STCS1與CHS對底物選擇性差別。4.次級代謝途徑相關(guān)P450的克隆及功能初步研究分析鈍鱗紫背苔cDNA文庫EST測序結(jié)果,找到幾十個標注為細胞色素P450的序列。選取其中幾個在愈傷組織、培養(yǎng)的葉狀體及野生型葉狀體中進行表達分析,發(fā)現(xiàn)其中幾個基因在聯(lián)芐含量高的組織中表達量明顯升高,推測可能與其聯(lián)芐的合成代謝相關(guān)。選取其中兩個基因通過5'RACE方法克隆了它們的全長,并擴增得到它們的cDNA及基因組序列,發(fā)現(xiàn)兩個基因的編碼區(qū)都有2個內(nèi)含子。生物信息學(xué)分析顯示,它們屬于P450家族,與CYP75家族具有較高的同源性,具有P450的保守結(jié)構(gòu)域,包括高度保守的血紅素結(jié)合部位FxxGxRxCxG和另外幾個P450s的標志性結(jié)構(gòu)域和序列A/GGxD/ETT/S (I-helix), KETLR (K-helix)和PERF/W等。構(gòu)建了P450s的體外表達及酶活檢測體系,為進行下一步體外及體內(nèi)功能研究提供了基礎(chǔ)。此外,這兩個P450的表達受到激素的誘導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】：苔類植物 次級代謝途徑 苯丙氨酸氨裂解酶 查爾酮合成酶 羧酸芪類合成酶 P450 蛋白晶體 非生物脅迫
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R914
【目錄】：

• 摘要7-11
• Abstract11-15
• 符號說明15-16
• 第一章 文獻綜述16-48
• 1 苔蘚植物16-17
• 2 苔類植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用17-18
• 3 聯(lián)芐類化合物次級代謝途徑研究18-20
• 3.1 聯(lián)芐及雙聯(lián)芐類化合物(Bibenzyls and Bisbibenzyls)18-19
• 3.2 聯(lián)芐類化合物生物合成途徑研究19-20
• 4 苔類植物次級代謝途徑關(guān)鍵酶20-37
• 4.1 苯丙氨酸裂解酶20-22
• 4.2 肉桂酸-4-羥化酶22-23
• 4.3 4-香豆酸：輔酶A連接酶23
• 4.4 Ⅲ型聚酮合酶家族23-33
• 4.5 NADPH-依賴的聚酮還原酶33-35
• 4.6 植物細胞色素P45035-37
• 5 本論文立題依據(jù)和研究內(nèi)容37-39
• 參考文獻39-48
• 第二章 鈍鱗紫背苔苯丙氨酸氨裂解酶(PaPAL)的克隆和功能鑒定及在非生物脅迫應(yīng)答中的表達特征48-78
• 1 引言48-50
• 2 實驗材料與試劑50-53
• 2.1 植物材料50
• 2.2 菌株與質(zhì)粒50
• 2.3 酶和試劑50-51
• 2.4 主要溶液和培養(yǎng)基51-52
• 2.5 實驗儀器和設(shè)備52
• 2.6 PCR引物序列52-53
• 3 實驗方法53-58
• 3.1 鈍鱗紫背苔中苯丙氨酸裂解酶PaPAL的克隆53-54
• 3.2 PaPAL的原核表達54-56
• 3.3 PaPAL體外酶活鑒定56-57
• 3.4 PaPAL在非生物脅迫應(yīng)答中的反應(yīng)57-58
• 3.5 在非生物脅迫應(yīng)答中植物葉狀體成分的變化58
• 4 實驗結(jié)果58-73
• 4.1 鈍鱗紫背苔中PaPAL的克隆及序列分析58-66
• 4.2 原核表達載體構(gòu)建及蛋白表達純化66-68
• 4.3 體外活性檢測結(jié)果68-70
• 4.4 非生物脅迫條件下PaPAL的表達變化及對成分的影響70-73
• 5 本章小結(jié)73
• 參考文獻73-78
• 第三章 苔類植物STCSs蛋白功能研究78-97
• 1 引言78-79
• 2 實驗材料與方法79-82
• 2.1 植物材料及菌株與質(zhì)粒79
• 2.2 PCR引物序列79-80
• 2.3 粗裂地錢轉(zhuǎn)錄組測序分析80
• 2.4 目的基因cDNA及基因組DNA全長擴增80
• 2.5 原核表達載體構(gòu)建及蛋白表達80
• 2.6 體外酶活鑒定80-82
• 3 實驗結(jié)果與討論82-94
• 3.1 STCSs的克隆和序列分析82-86
• 3.2 STCSs進化樹分析86-88
• 3.3 STCSs基因組分析88-89
• 3.4 原核表達89-90
• 3.5 體外酶活結(jié)果與分析90-94
• 4 本章小結(jié)94-95
• 參考文獻95-97
• 第四章 STCS1蛋白功能及初步晶體學(xué)研究97-127
• 1 引言97-98
• 2 實驗材料與方法98-105
• 2.1 菌株與質(zhì)粒98-99
• 2.2 試劑和儀器99
• 2.3 培養(yǎng)基和溶液配制99-100
• 2.4 蛋白表達載體構(gòu)建100
• 2.5 蛋白表達檢測及大量制備100-102
• 2.6 STCS1晶體的獲得102-104
• 2.7 晶體結(jié)構(gòu)的解析104-105
• 3 實驗結(jié)果與討論105-124
• 3.1 STCS1蛋白表達與小量制備105-109
• 3.2 STCS1蛋白大量制備109-111
• 3.3 STCS1蛋白晶體的獲得與數(shù)據(jù)收集111-115
• 3.4 晶體結(jié)構(gòu)與模型修正115-117
• 3.5 STCS1整體結(jié)構(gòu)描述117-120
• 3.6 STCS1與同源序列比對120-121
• 3.7 STCS1與底物及產(chǎn)物分子對接121-123
• 3.8 STCS1活性位點與催化機制探討123-124
• 4 本章小結(jié)124
• 參考文獻124-127
• 第五章 聯(lián)芐合成途徑相關(guān)P450克隆及功能研究127-148
• 1 引言127
• 2 實驗材料與方法127-132
• 2.1 植物材料及菌株與質(zhì)粒127-128
• 2.2 試劑溶液、酶等128
• 2.3 PCR引物序列128-129
• 2.4 苔類植物不同類型的組織P450表達差異129
• 2.5 基因克隆及序列分析129-130
• 2.6 酵母表達、微粒體制備130-132
• 2.7 體外酶活檢測132
• 2.8 兩個P450基因在激素處理后的表達特征132
• 3 實驗結(jié)果132-144
• 3.1 苔類植物中P450在不同組織差異表達分析132-133
• 3.2 苔類植物中兩個P450的克隆及序列分析133-140
• 3.3 PaF3'H1與PaF3'H2進化分析140-141
• 3.4 P450酵母表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化141
• 3.5 微粒體制備及體外酶活檢測141-143
• 3.6 激素刺激因子引起P450表達的變化143-144
• 4 小結(jié)144-145
• 5 下一步工作計劃145
• 參考文獻145-148
• 致謝148-149
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄149-150
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表150

【參考文獻】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 武一鳳;鈍鱗紫背苔苯丙素及聯(lián)芐類化合物生物合成機制研究[D];山東大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：苔類植物聯(lián)芐合成相關(guān)基因功能鑒定及催化機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：422400