本文關(guān)鍵詞：Tudor-SN蛋白調(diào)控細胞內(nèi)應(yīng)激顆粒組裝的分子機制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:應(yīng)激顆粒(Stress Granules,SGs)與加工體(Processing Bodies,PBs)是真核細胞受到氧化應(yīng)激、熱休克、紫外線照射及病毒感染等各種環(huán)境刺激時在胞漿中產(chǎn)生的與m RNA代謝密切相關(guān)的顆粒狀結(jié)構(gòu)。本課題組前期結(jié)果表明當He La細胞受到外界刺激,如0.5m M亞砷酸鈉氧化應(yīng)激或45℃熱休克時,Tudor-SN(Tudor Staphylococcal Nuclease)蛋白可以參與胞漿中SGs的組裝,但深入的分子機制尚不完全清楚。本課題旨在進一步分析Tudor-SN蛋白的應(yīng)激動力學屬性及其在SGs組裝動力學中的作用機制。方法:本課題實驗分為三大部分,第一部分:①利用細胞免疫熒光(Immunofluorescence,IF)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染-共聚焦顯微鏡分析Tudor-SN蛋白顆粒與SGs/PBs的共定位關(guān)系;②利用熒光漂白后恢復(fù)(Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)技術(shù)分析He La細胞中Tudor-SN蛋白顆粒的胞內(nèi)應(yīng)激動力學屬性;③利用熒光漂白損失(Fluorescence loss in photobleaching,FLIP)技術(shù)分析Tudor-SN蛋白的核/漿穿梭屬性及與SGs組裝的相關(guān)性分析。第二部分:①利用AKTA純化系統(tǒng)、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、GST融合蛋白釣取(GST-pulldown)技術(shù)進行SGs中包含Tudor-SN的蛋白應(yīng)激復(fù)合物分析;②利用Oligo(d T)親和層析、細胞熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP)等技術(shù)分析SGs中Tudor-SN蛋白與poly(A)+m RNA、AGTR1-3'UTR的結(jié)合及共定位關(guān)系。第三部分:①利用GFP-sh RNA干擾和熒光漂白后恢復(fù)(FRAP)技術(shù)分析He La細胞中Tudor-SN對于SGs/PBs蛋白組裝動力學的影響;②以Tudor-SN基因敲除(Tudor-SN-/-)小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)為實驗對象,分析Tudor-SN對于poly(A)+m RNA應(yīng)激顆粒形成的影響;③利用si RNA干擾和多聚核糖體解聚曲線分析研究Tudor-SN蛋白與多聚核糖體應(yīng)激解聚的相關(guān)性;④以AGTR1-3'UTR(3'-untranslated region of angiotensin II receptor,type 1 m RNA)為具體靶基因,利用GFP-MS2系統(tǒng)實現(xiàn)AGTR1-3'UTR的活細胞內(nèi)動態(tài)標記,并結(jié)合si RNA干擾、ds Red-sh RNA干擾、熒光漂白后恢復(fù)(FRAP)、細胞免疫熒光、活細胞工作站等技術(shù)分析Tudor-SN蛋白對AGTR1-3'UTR應(yīng)激動力學行為的調(diào)控作用。結(jié)果:第一部分:①He La細胞內(nèi)源性Tudor-SN蛋白與SGs標記蛋白(Hu R、PABP1、G3BP)存在顆粒共定位關(guān)系,與SGs/PBs共同蛋白(AGO1/2)部分共定位,但與PBs標記蛋白(DCP1a、GW182)并無共定位關(guān)系;外源性RFP-Tudor-SN融合蛋白與GFP-AGO2蛋白存在一定的顆粒共定位關(guān)系,但不與GFP-DCP1a/b、GFP-DCP2、GFP-GW182以及GFP蛋白共定位。②給予細胞高強度激光漂白后,興趣區(qū)Tudor-SN蛋白顆粒的熒光強度降低到原來的~23%,隨后熒光信息恢復(fù)至漂白前熒光強度的~66.3%,光漂白后恢復(fù)速率t1/2值為9.22±1.72sec。③給予細胞脈沖式重復(fù)光漂白后,興趣區(qū)Tudor-SN蛋白顆粒熒光信號完全消失,伴隨同一細胞內(nèi)鄰近檢測區(qū)Tudor-SN蛋白顆粒和細胞胞核內(nèi)Tudor-SN蛋白熒光信號的逐漸降低。第二部分:①Tudor-SN蛋白可以與TIAR、AGO1/2、PABP1、e IF5A、Hu R、TTP等蛋白形成應(yīng)激復(fù)合物,但不包含DCP1a蛋白,另外,Tudor-SN蛋白的SN1結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)其與PABP1、TIAR、AGO1/2蛋白結(jié)合作用的主要功能片段。②Tudor-SN可通過RNA的橋聯(lián)作用與PABP1蛋白結(jié)合,還可與poly(A)+m RNA、AGTR1-3'UTR結(jié)合并共同定位于SGs結(jié)構(gòu)中。第三部分:①與對照組相比,當下調(diào)He La細胞內(nèi)Tudor-SN蛋白表達時,SGs顆粒興趣區(qū)光漂白后恢復(fù)速率t1/2值由4.35±1.26sec升至7.01±1.55sec(P0.05),而PBs顆粒興趣區(qū)t1/2值差異無統(tǒng)計學意義。②Tudor-SN基因敲除不能完全阻止但可有效抑制poly(A)+m RNA應(yīng)激顆粒的形成。③應(yīng)激狀態(tài)下,以放線菌酮或嘌呤霉素干擾多聚核糖體解聚過程可以影響Tudor-SN應(yīng)激顆粒的胞漿組裝,而以si RNA干擾技術(shù)下調(diào)細胞內(nèi)Tudor-SN的表達,并未觀察到多聚核糖體應(yīng)激解聚過程的改變。④利用GFP-MS2系統(tǒng)構(gòu)建p T7-AGTR1-3'UTR-24×MS2重組真核質(zhì)粒,在活細胞內(nèi)成功實現(xiàn)對于AGTR1-3'UTR的GFP標記,后者與Tudor-SN蛋白呈現(xiàn)相同的顆粒組裝過程。當下調(diào)細胞內(nèi)Tudor-SN蛋白表達時,AGTR1-3'UTR顆粒組裝過程受到影響。給予細胞高強度激光漂白處理,AGTR1-3'UTR顆粒興趣區(qū)光漂白后恢復(fù)速率t1/2值由9.96±0.78sec升至16.77±1.94sec(P0.05)。結(jié)論:1)Tudor-SN蛋白是一種SGs特異性蛋白,具有核漿穿梭特性,后者參與Tudor-SN蛋白顆粒呈現(xiàn)高度動態(tài)性的組裝過程。2)Tudor-SN與PABP1、TIAR等多種應(yīng)激蛋白以及poly(A)+m RNA相互作用,形成應(yīng)激蛋白-核酸復(fù)合物,共同參與細胞胞漿SGs結(jié)構(gòu)的形成。3)Tudor-SN蛋白對于多聚核糖體的應(yīng)激解聚過程并無影響,但可調(diào)控SGs蛋白-核酸成分(如G3BP蛋白、AGTR1-3'UTR)的應(yīng)激組裝動力學行為。
【關(guān)鍵詞】：Tudor-SN 應(yīng)激顆粒 加工體 poly(A)+mRNA AGTR1-3'UTR
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語12-16
• 前言16-22
• 研究現(xiàn)狀、成果16-19
• 研究目的、方法19-22
• 一、Tudor-SN蛋白的應(yīng)激動力學屬性分析22-41
• 1.1 對象和方法22-31
• 1.1.1 細胞和質(zhì)粒22
• 1.1.2 主要試劑22-23
• 1.1.3 主要溶液、緩沖液和培養(yǎng)基23-24
• 1.1.4 主要儀器、設(shè)備24-25
• 1.1.5 實驗方法及流程25-31
• 1.2 結(jié)果31-38
• 1.2.1 Tudor-SN蛋白顆粒與SGs/PBs的共定位分析31-34
• 1.2.2 Tudor-SN蛋白顆粒的組裝動力學分析34-35
• 1.2.3 Tudor-SN蛋白的核/漿穿梭及與SGs組裝的相關(guān)性分析35-38
• 1.3 討論38-40
• 1.4 小結(jié)40-41
• 二、包含Tudor-SN的蛋白-核酸應(yīng)激復(fù)合物分析41-61
• 2.1 對象和方法41-53
• 2.1.1 細胞與質(zhì)粒41
• 2.1.2 主要試劑41-43
• 2.1.3 主要溶液、緩沖液和培養(yǎng)基43-46
• 2.1.4 儀器設(shè)備46
• 2.1.5 實驗方法及流程46-53
• 2.2 結(jié)果53-58
• 2.2.1 Tudor-SN應(yīng)激蛋白-蛋白復(fù)合物分析53-55
• 2.2.2 Tudor-SN應(yīng)激蛋白-核酸復(fù)合物分析55-58
• 2.3 討論58-60
• 2.4 小結(jié)60-61
• 三、Tudor-SN對于SGs應(yīng)激組裝動力學的調(diào)控61-85
• 3.1 對象和方法61-71
• 3.1.1 細胞和質(zhì)粒61-62
• 3.1.2 主要試劑62-63
• 3.1.3 主要溶液、緩沖液和培養(yǎng)基63
• 3.1.4 儀器設(shè)備63
• 3.1.5 實驗方法及流程63-71
• 3.2 結(jié)果71-82
• 3.2.1 Tudor-SN對于SGs/PBs蛋白組裝動力學的影響71-72
• 3.2.2 Tudor-SN基因敲除對于poly(A)+ mRNA應(yīng)激顆粒形成的影響72-73
• 3.2.3 Tudor-SN蛋白與多聚核糖體應(yīng)激解聚的相關(guān)性分析73-74
• 3.2.4 Tudor-SN蛋白調(diào)控AGTR1-3'UTR的應(yīng)激動力學行為74-82
• 3.3 討論82-84
• 3.4 小結(jié)84-85
• 全文結(jié)論85-88
• 論文創(chuàng)新點88-89
• 參考文獻89-102
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明102-105
• 綜述 細胞內(nèi)RNA標記技術(shù)的研究進展105-125
• 綜述參考文獻115-125
• 致謝125

【共引文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：Tudor-SN蛋白調(diào)控細胞內(nèi)應(yīng)激顆粒組裝的分子機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：417833