發(fā)布時間：2017-05-31 22:16

  本文關(guān)鍵詞：牙髓成纖維細胞NLRP3炎癥體的表達、活化及作用機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：固有免疫系統(tǒng)是保護宿主免受病原體侵害的第一道屏障,可以借助種系編碼的模式識別受體識別來自病原微生物的危險信號——病原體相關(guān)分子模式以及宿主自身來源的危險信號——危險相關(guān)分子模式。目前已發(fā)現(xiàn)的模式識別受體有四大類,包括TLRs、CLRs、RLRs以及NLRs。不同于其他模式識別受體,一部分NLRs的家族成員可以形成炎癥體、調(diào)節(jié)caspase-1活性,后者影響IL-1β的成熟和分泌。NLRP3是目前研究最為深入和廣泛的一種炎癥體,在多種疾病的病理過程發(fā)揮非常重要的作用。本研究組前期研究結(jié)果表明,NLRP3炎癥體在人牙髓成纖維細胞(Human dental pulp fibroblasts,HDPFs)中表達,并且與牙髓固有免疫以及損傷修復(fù)具有非常密切的關(guān)系。但NLRP3炎癥體在牙髓成纖維細胞中的作用如何?那些因素參與NLRP3表達的調(diào)控?其激活機制又是如何?這些問題目前尚不清楚。闡明這些問題有助于加深對牙髓組織固有免疫的理解,并為尋找牙髓炎癥新的治療方法奠定基礎(chǔ)。研究目的:1.探討NLRP3炎癥體在HDPFs中的作用及作用機制2.探討牙HDPFs中NLRP3炎癥體的激活機制3.探討HDPFs中NLRP3的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制4.探討HDPFs中NLRP3的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制方法:1.用LPS和ATP刺激HDPFs,RT-PCR和western-blot檢測NLRP3炎癥體相關(guān)基因的表達水平,ELISA檢測細胞外IL-1β濃度。通過構(gòu)建sh RNA慢病毒載體分別沉默NLRP3和caspase-1,觀察兩種基因?qū)DPFs細胞分泌IL-1β的影響。2.利用熒光染料標(biāo)記細胞內(nèi)ROS和超氧化物,激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測ATP刺激對HDPFs中ROS水平的影響;利用ROS抑制劑阻斷ROS的生成,western-blot和ELISA檢測p20表達水平和IL-1β分泌水平,觀察其對NLRP3炎癥體活性的影響。3.利用CLI-095、Pepinh-MYD和Bay 11-7082分別抑制TLR4、My D88和NF-κB,LPS刺激HDPFs,RT-PCR和western-blot檢測NLRP3、caspase-1及IL-1βm RNA表達水平,ELISA檢測細胞外IL-1β濃度。4.RT-PCR檢測LPS和ATP刺激時HDPFs中mi R-223和mi R-22表達水平;熒光素酶報告檢測確認(rèn)mi R-223和mi R-22與靶基因NLRP3的結(jié)合;轉(zhuǎn)染mi RNA mimics過表達mi R-223和mi R-22,western-blot和ELISA檢測NLRP3炎癥體活性。結(jié)果:1.LPS刺激引起NLRP3、caspase-1和IL-1βm RNA表達水平升高;LPS和ATP共同刺激引起HDPFs釋放IL-1β;沉默NLRP3和caspase-1均可抑制IL-1β的分泌,但對IL-1βm RNA表達水平無影響。2.ATP刺激誘導(dǎo)HDPFs產(chǎn)生大量ROS;ROS抑制劑可抑制ATP刺激引起的p20的表達和IL-1β分泌。3.抑制TLR4可顯著抑制NLRP3、caspase-1和IL-1βm RNA表達水平,而抑制My D88和NF-κB僅可抑制NLRP3和IL-1βm RNA表達水平,對caspase-1的表達無明顯影響。4.RT-PCR結(jié)果證明mi R-223和mi R-22在HDPFs中確有表達,LPS刺激導(dǎo)致二者表達水平下降,熒光素酶報告檢測結(jié)果證實mi R-223和mi R-22均可與NLRP33’UTR結(jié)合;過表達mi R-223和mi R-22會導(dǎo)致NLRP3蛋白表達水平下降,IL-1β分泌減少。結(jié)論:1.NLRP3炎癥體對HDPFs細胞IL-1β的分泌起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用2.ATP激活NLRP3炎癥體依賴細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生3.TLR4-My D88-NF-κB信號通路調(diào)節(jié)NLRP3的表達水平4.mi R-223和mi R-22可抑制NLRP3蛋白表達并降低NLRP3炎癥體活性
【關(guān)鍵詞】：固有免疫 模式識別受體 炎癥體 基因沉默 活性氧簇 TLR4 MyD88依賴信號通路 miRNA
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文獻回顧17-35
• 一、炎癥和模式識別受體17-18
• 二、TOLL樣受體家族及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路概述18-25
• 三、NOD樣受體家族和炎癥體概述25-31
• 四、TLRs等信號通路對炎癥體活性和IL-1β 分泌的調(diào)節(jié)31-32
• 五、MicroRNA對炎癥及炎癥體活性的調(diào)節(jié)32-33
• 六、牙髓成纖維細胞在牙髓固有免疫應(yīng)答中的作用33-35
• 第一部分、牙髓成纖維細胞中NLRP3 炎癥體的表達及其對IL-1β 分泌的影響35-63
• 實驗一、LPS和ATP刺激時牙髓成纖維細胞中NLRP3 炎癥體及IL-1β 表達水平的變化36-47
• 1、材料36-37
• 2、方法37-43
• 3、結(jié)果43-45
• 4、討論45-47
• 實驗二、NLRP3 和Caspase-1 shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及相應(yīng)基因沉默細胞系的建立47-56
• 1、材料47-48
• 2、方法48-52
• 3、結(jié)果52-55
• 4、討論55-56
• 實驗三、NLRP3 和Caspase-1 基因沉默對HDPF分泌IL-1β 的影響56-63
• 1、材料56
• 2、方法56-58
• 3、結(jié)果58-60
• 4、討論60-63
• 第二部分、外源性ATP刺激對HDPF中ROS水平及NLRP3 炎癥體活性影響63-74
• 實驗一、ATP刺激時HDPF中ROS水平變化64-69
• 1、材料64
• 2、方法64-66
• 3、結(jié)果66-67
• 4、討論67-69
• 實驗二、ROS抑制劑對ATP激活NLRP3 炎癥體的影響69-74
• 1、材料69
• 2、方法69-70
• 3、結(jié)果70-72
• 4、討論72-74
• 第三部分、TLR4、MyD88、NF-κB信號通路對HDPF中NLRP3 炎癥體表達的影響74-80
• 1、材料75
• 2、方法75-76
• 3、結(jié)果76-78
• 4、討論78-80
• 第四部分、miR223 和mi R22 對HDPF中NLRP3 炎癥體表達的影響80-98
• 實驗一、miR223 和miR22 在HDPF中的表達及LPS對二者表達水平的影響81-85
• 1、材料81
• 2、方法81-83
• 3、結(jié)果83-84
• 4、討論84-85
• 實驗二、體外雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR223 和miR22 對NLRP3 的調(diào)控85-91
• 1、材料85
• 2、方法85-89
• 3、結(jié)果89-90
• 4、討論90-91
• 實驗三、過表達miR223 和miR22 對HDPF中NLRP3 表達及IL-1β 分泌的調(diào)控91-98
• 1、材料91
• 2、方法91-93
• 3、結(jié)果93-95
• 4、討論95-98
• 小結(jié)98-99
• 參考文獻99-111
• 附錄111-114
• 一、shRNA-GV248 重組慢病毒載體測序結(jié)果：111-113
• 二、NLRP33’ UTR及 3’ UTR MUT測序結(jié)果：113-114
• 個人簡歷及研究成果114-115
• 致謝115

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 梁芳;曾朝陽;李桂源;;鼻咽癌相關(guān)固有免疫分子及其潛在臨床轉(zhuǎn)化前景[J];轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志;2013年01期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張曉;IL-8及其受體在人牙髓干細胞的表達及其調(diào)控的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

2 王海婧;NLRP3/Caspase-1在牙髓組織中的表達及其與牙髓損傷修復(fù)的關(guān)系研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

3 蔣文凱;人牙髓成纖維細胞NLRP3/Caspase-1炎癥體通路機制的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：牙髓成纖維細胞NLRP3炎癥體的表達、活化及作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：410795