本文關(guān)鍵詞：膽道腫瘤循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測及基因組擴(kuò)增，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：循環(huán)腫瘤細(xì)胞被認(rèn)為與惡性腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),因其對腫瘤的早期斷、臨床分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥監(jiān)測、預(yù)后判斷、開發(fā)新的治療靶點具有重要值,近年來受到研究者的廣泛重視。由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測創(chuàng)傷小,簡便易行,便于動態(tài)監(jiān)測,該檢測技術(shù)常被稱為“液體活檢”。目前已經(jīng)有多種富集、分選循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)的方法相繼出現(xiàn)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲、計數(shù)及下游分析也已應(yīng)用于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌等研究中。膽道腫瘤包括膽囊癌和膽管癌,是一類侵襲性強(qiáng)、惡性度高的疾病,因其在臨床上診斷、治療困難,預(yù)后差,嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。然而,目前國內(nèi)尚無對膽道腫瘤患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的系統(tǒng)性研究。目前,人們對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究除了聚焦于計數(shù)與臨床分期、預(yù)后的相關(guān)以外,還試圖通過體外獲取單個循環(huán)腫瘤細(xì)胞基因組及擴(kuò)增技術(shù),為實現(xiàn)下游系列分子水平研究做準(zhǔn)備,諸如：數(shù)字PCR、基因組測序等。本研究中對該術(shù)平臺的開發(fā)和應(yīng)用,為穩(wěn)定獲得循環(huán)腫瘤細(xì)胞單細(xì)胞基因組及其擴(kuò)增產(chǎn)物,從而進(jìn)行臨床耐藥相關(guān)位點分析、開展疾病轉(zhuǎn)歸動態(tài)監(jiān)測、研究腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程相關(guān)分子變化腫瘤的異質(zhì)性研究提供了前提。方法：1、選取臨床樣本,根據(jù)預(yù)設(shè)的納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)選擇入組病人,根據(jù)手術(shù)情況(是否行根治性切除)及術(shù)后病理決定循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的次數(shù)和時間點,并制定隨訪方案。2、征得患者或其家屬知情同意后,利用GILUPI公司研制的循環(huán)腫瘤細(xì)胞探針從外周血(肘靜脈)捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞。3、經(jīng)過對GILUPI探針上捕獲細(xì)胞的洗滌、固定、穿孔、封閉步驟后,利用多種熒光直標(biāo)的單克隆抗體,包括：上皮細(xì)胞粘附分子抗體,細(xì)胞角蛋白抗體,CD45,以及Hoechst 33342對探針上粘附的細(xì)胞進(jìn)行染色。4、在熒光顯微鏡下利用不同濾光片通道對探針上的細(xì)胞進(jìn)行觀察、拍照、鑒定,對符合標(biāo)準(zhǔn)鑒定為循環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。5、統(tǒng)計分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞計數(shù)與患者腫瘤分期、分型、疾病進(jìn)展與預(yù)后之間的關(guān)系,探討計數(shù)結(jié)果的臨床意義與價值。6、探索多種富集、分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞后體外基因組獲取擴(kuò)增技術(shù),包括顯微切割、單細(xì)胞毛細(xì)玻璃纖維管顯微操作、DEPArray非均勻電場細(xì)胞操作系統(tǒng)等。結(jié)果：1、膽道惡性腫瘤組織中上皮細(xì)胞粘附分子多為高度-中度表達(dá)。2、通過將GILUPI探針置入肘部靜脈30分鐘,能夠捕獲到部分膽道惡性腫瘤患者外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞,并實現(xiàn)對附著于探針上的細(xì)胞的免疫熒光染色鑒定和計數(shù)。并且這一臨床操作基本安全,本研究中未出現(xiàn)并發(fā)癥和不良反應(yīng)。3、將檢測臨界值設(shè)定為2：以檢測到的外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)大于或等于2個定義為陽性,小于2個為陰性。在此設(shè)定下,膽道惡性腫瘤患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性率為52.5%,計數(shù)結(jié)果為2.95±3.78；膽道良性疾病患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性率為11%,計數(shù)結(jié)果為0.56±1.33個4、膽道惡性腫瘤患者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期循環(huán)腫瘤細(xì)胞計數(shù)分別為：1.30±1.57個2.00±2.88個,6.38±4.60個,12個；檢出率分別為40%,43%,88%,1/1.5、91%的膽道惡性腫瘤患者在行根治性切除手術(shù)后,復(fù)查外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞計數(shù)較術(shù)前檢測值下降。5、循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測對肝膽惡性腫瘤區(qū)別于良性疾病的陽性預(yù)測值為95.5%.7、密度梯度離心法、帶孔濾膜加壓過濾-截留法,利用毛細(xì)玻璃纖維管顯微操作技術(shù)、顯微切割紅外粘取技術(shù)、非均勻電場單細(xì)胞操作技術(shù)在對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集分離和單細(xì)胞精細(xì)操作方面各有特點,能滿足不同類型的實驗需求。根據(jù)實驗需求綜合運用各種技術(shù)平臺,可以實現(xiàn)對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高通量、精準(zhǔn)、便捷、無損操作8、利用REPLI-g Single Cell Kit可以實現(xiàn)對單個循環(huán)腫瘤細(xì)胞基因組的獲取和擴(kuò)增。結(jié)論：1、相比于良性疾病患者,膽道惡性腫瘤患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的陽性率明顯升高,計數(shù)結(jié)果也較多,兩組病人之間上述兩個指標(biāo)均有統(tǒng)計學(xué)差異。2、膽道惡性腫瘤分期與外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞計數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)性。3、循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測在對病程動態(tài)檢測中可以發(fā)揮重要作用。4、對于膽囊占位性病變,術(shù)前檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞可能有助于對膽囊黃色肉芽腫性炎和膽囊癌的鑒別。5、根據(jù)實驗需求綜合運用各種技術(shù)平臺,可以實現(xiàn)對循環(huán)腫瘤細(xì)胞高通量、精準(zhǔn)、便捷、無損的富集和單細(xì)胞操作,以及基因組的體外獲取和擴(kuò)增。
【關(guān)鍵詞】：循環(huán)腫瘤細(xì)胞 膽道腫瘤 上皮細(xì)胞粘附分子 基因組
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.8
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 第一部分 膽道腫瘤外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)檢測11-32
• 引言11-13
• 材料與方法13-19
• 結(jié)果19-27
• 討論27-31
• 結(jié)論31-32
• 第二部分 外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞基因組體外獲取擴(kuò)增技術(shù)32-61
• 引言32-35
• 材料與方法35-43
• 結(jié)果43-51
• 討論51-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 綜述67-72
• 參考文獻(xiàn)70-72
• 在學(xué)期間發(fā)表論文72-73
• 致謝73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：膽道腫瘤循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測及基因組擴(kuò)增，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：410967