液滴微流控技術(shù)能夠以高通量的方式生成尺寸均一的微液滴。微液滴數(shù)字PCR(dd PCR)能夠?qū)崿F(xiàn)核酸的絕對(duì)定量分析,近年來(lái)在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域開(kāi)始出現(xiàn)廣泛而重要的應(yīng)用。準(zhǔn)確性和客觀性是dd PCR用于臨床檢驗(yàn)的兩大需求。目前,用于核酸絕對(duì)定量的高精準(zhǔn)和自動(dòng)化的dd PCR系統(tǒng)仍未見(jiàn)報(bào)道。本文構(gòu)建了一套創(chuàng)新的高精準(zhǔn)和自動(dòng)化的dd PCR系統(tǒng),從微液滴生成過(guò)程和檢測(cè)過(guò)了兩方面進(jìn)行了高精準(zhǔn)和自動(dòng)化的定量研究。主要的研究?jī)?nèi)容包括:(1)微液滴生成過(guò)程的高精準(zhǔn)和自動(dòng)化分析。本文設(shè)計(jì)并搭建了微液滴生成裝置,并使用高速相機(jī)對(duì)微液滴的生成過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)觀察。在此基礎(chǔ)上,本文提出了一種創(chuàng)新的微液滴生成過(guò)程的自動(dòng)化監(jiān)測(cè)方法——余弦相似度算法。該算法利用微液滴生成過(guò)程的周期性,只需使用高速相機(jī)采集的視頻就能高精準(zhǔn)和自動(dòng)化地計(jì)算微液滴生成頻率的均值和變異系數(shù),前者用于精準(zhǔn)確定生成微液滴數(shù),后者用于精準(zhǔn)確定微液滴生成過(guò)程的均一性。本文使用了四種微液滴生成過(guò)程對(duì)余弦相似度算法進(jìn)行測(cè)試,測(cè)試結(jié)果證明余弦相似度算法能夠高精準(zhǔn)和自動(dòng)化地確定生成微液滴數(shù)和微液滴生成過(guò)程的均一性。(2)微液滴檢測(cè)過(guò)程的高精準(zhǔn)和自動(dòng)化分析。本文設(shè)計(jì)...

【文章頁(yè)數(shù)】：290 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖1.3基于微孔板的

諞淮鶳CR技術(shù)一般使用凝膠電泳作為定性檢測(cè)手段。1992年，Higuchi等開(kāi)發(fā)了第二代PCR技術(shù)——實(shí)時(shí)定量PCR（quantitativePCR,qPCR）技術(shù)，使用與核酸特異性結(jié)合后熒光增強(qiáng)的染料實(shí)現(xiàn)被擴(kuò)增核酸的相對(duì)定量[36]。第二代PCR技術(shù)一般使用熒光染料或Taqma....

圖1.4BEAMing技術(shù)的原理[39]

第1章引言6反應(yīng)體系滴加到礦物油（含4.5%Span80，0.40%Tween80和0.05%TritonX-100作為表面活性劑）中形成約3×109個(gè)微液滴（直徑為5.4±2.7μm），作為微孔板的“孔”進(jìn)行數(shù)字PCR，PCR產(chǎn)物被富集到磁珠上進(jìn)行純化，最后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)磁珠....

圖1.5商業(yè)化的微

第1章引言7產(chǎn)品RainDrop（圖1.5b）[41]。該產(chǎn)品能夠?qū)?0–50μLPCR反應(yīng)體系分裝成5×106–1×107個(gè)均一的微液滴[46]，在PCR反應(yīng)完成后，將帶有微液滴的試管裝載到微液滴檢測(cè)芯片上，用連續(xù)相驅(qū)動(dòng)微液滴進(jìn)入檢測(cè)芯片的微流道中，以流式細(xì)胞術(shù)的方式對(duì)微液滴進(jìn)....

圖1.6使用瓊脂糖微凝膠的ddPCR技術(shù)[51]

第1章引言8糖微凝膠的ddPCR技術(shù)，該技術(shù)使用低溫可固化的瓊脂糖微凝膠作為數(shù)字PCR中常用的的微液滴，有效提高了微液滴在PCR溫度循環(huán)過(guò)程中的穩(wěn)定性，且瓊脂糖微凝膠能直接使用商業(yè)化的流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)（圖1.6）[51]。2013年，Abate研究組的Eastbur....

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