膠原蛋白是人體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì),起著維持組織和器官結(jié)構(gòu)完整性的作用。它在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的折疊和組裝需要多種輔助蛋白的參與,如脯氨酸3-羥化酶(P3H)、脯氨酸4-羥化酶(P4H)、分子伴侶HSP47等。其中脯氨酸3-羥化酶復(fù)合物(P3H1/CRTAP/PPIB)可以特異性地羥化I型膠原α1鏈986位的脯氨酸,同時該復(fù)合物還具有二硫鍵異構(gòu)酶和脯氨酰順反異構(gòu)酶的活性。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物中任一組分的缺失均會導(dǎo)致膠原蛋白的錯誤折疊和成骨不全癥(OI)的發(fā)生。然而P3H1復(fù)合物中這三個蛋白如何相互作用并定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子機制并不清楚,且該復(fù)合物特異性地3-羥基化膠原的結(jié)構(gòu)生物學(xué)機制也未明確。針對這些問題,我們首先分析了三元復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中駐留及組裝的分子機制。由于構(gòu)成復(fù)合物的三個蛋白中只有P3H1擁有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號KDEL序列,為此我們刪除了位于P3H1羧基末端的該序列,并檢測了其對復(fù)合物定位的影響。我們發(fā)現(xiàn)該信號肽的去除導(dǎo)致P3H1和CRTAP共分泌到胞外,而且共分泌是通過P3H1的氨基端結(jié)構(gòu)域和CRTAP相互作用所介導(dǎo)。體外組裝實驗證實,共分泌的P3H1/CRTAP復(fù)合物可以和P...

【文章頁數(shù)】：122 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 膠原蛋白的構(gòu)象與分類
    1.2 膠原蛋白的折疊與組裝
    1.3 脯氨酸羥化酶在膠原合成過程中的作用
    1.4 脯氨酸羥化酶的功能與結(jié)構(gòu)
        1.4.1 脯氨酸羥化酶的羥化機制
        1.4.2 脯氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)研究進展
            1.4.2.1 膠原蛋白脯氨酸4-羥化酶的結(jié)構(gòu)研究進展
            1.4.2.2 低氧誘導(dǎo)因子脯氨酸羥化酶的結(jié)構(gòu)研究進展
            1.4.2.3 植物脯氨酸羥化酶的結(jié)構(gòu)研究進展
            1.4.2.4 膠原脯氨酸3-羥化酶結(jié)構(gòu)研究進展
    1.5 成骨不全癥
    1.6 P3H1/CRTAP/PPIB復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能
    1.7 本課題研究內(nèi)容和意義
第二章 材料和方法
    2.1 主要試劑耗材
    2.2 主要實驗儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 基因的獲取及相關(guān)克隆構(gòu)建
            2.3.1.1 脯氨酸3-羥化酶家族基因的獲得
            2.3.1.2 質(zhì)粒圖譜
            2.3.1.3 脯氨酸3-羥化酶P3H1 復(fù)合物的質(zhì)粒構(gòu)建
            2.3.1.4 脯氨酸3-羥化酶家族催化結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒構(gòu)建
            2.3.1.5 質(zhì)粒的基因突變
            2.3.1.6 質(zhì)粒的大量抽提
        2.3.2 蛋白的表達及純化
            2.3.2.1 蛋白純化基本原理
            2.3.2.2 PPIB原核表達及純化方法
            2.3.2.3 脯氨酸3-羥化酶的真核表達及純化方法
        2.3.3 P3H1/CRTAP/PPIB組裝的功能實驗
            2.3.3.1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染及蛋白質(zhì)印記法
            2.3.3.2 凝膠過濾層析法
            2.3.3.3 mPEG半胱氨酸修飾法
            2.3.3.4 蛋白質(zhì)巰基-羧基化學(xué)交聯(lián)法
            2.3.3.5 質(zhì)譜法鑒定復(fù)合物交聯(lián)片段
            2.3.3.6 PPIB酶活性測定
            2.3.3.7 免疫共沉淀實驗
        2.3.4 蛋白質(zhì)結(jié)晶實驗與晶體優(yōu)化
            2.3.4.1 蛋白晶體初篩
            2.3.4.2 蛋白晶體優(yōu)化
        2.3.5 蛋白晶體衍射和結(jié)構(gòu)解析
            2.3.5.1 晶體X射線衍射
            2.3.5.2 晶體結(jié)構(gòu)解析
第三章 P3H1/CRTAP/PPIB三元復(fù)合物的組裝
    3.1 三元復(fù)合物的組裝
        3.1.1 P3H1的KDEL信號肽決定了P3H1和CRTAP的共定位
        3.1.2 CRTAP結(jié)合在P3H1的N端
        3.1.3 P3H1與CRTAP的 C末端參與PPIB的結(jié)合
        3.1.4 鑒定PPIB參與P3H1/CRTAP結(jié)合的表面
        3.1.5 鑒定P3H1/CRTAP中參與與PPIB結(jié)合的位點
        3.1.6 P3H1/CRTAP/PPIB三元復(fù)合組裝示意圖
        3.1.7 PPIB的病理性突變阻礙P3H1 三元復(fù)合物的形成
    3.2 本章討論
        3.2.1 P3H1 復(fù)合物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留機制
        3.2.2 P3H1 復(fù)合物的分子內(nèi)相互作用
        3.2.3 PPIB病理性突變對P3H1 復(fù)合物功能的啟示
第四章 脯氨酸3-羥化酶催化功能域的結(jié)構(gòu)特點
    4.1 脯氨酸3-羥化酶催化功能域蛋白的制備與結(jié)晶
        4.1.1 P3H1-C蛋白的制備
        4.1.2 P3H1-C去糖基化與晶體生長效果改善
        4.1.3 P3H2-C蛋白的制備
        4.1.4 P3H2-C的的晶體生長結(jié)果
        4.1.5 P3H3-C蛋白的的制備
        4.1.6 P3H3-C的的晶體生長及優(yōu)化
    4.2 脯氨酸3-羥化酶催化功能域的結(jié)構(gòu)特點
        4.2.1 脯氨酸3-羥化酶催化功能域的晶體構(gòu)成
        4.2.2 脯氨酸3-羥化酶催化功能域的整體結(jié)構(gòu)
            4.2.2.1 P3H1-C與 P3H3-C的整體結(jié)構(gòu)比較
            4.2.2.2 P3H1-C與 P3H3-C的活性中心比較
    4.3 脯氨酸3-羥化酶催化功能域與P4H結(jié)構(gòu)的異同
        4.3.1 脯氨酸3-羥化酶催化功能域與CrP4H,PHD2 結(jié)構(gòu)的整體比較
        4.3.2 脯氨酸3-羥化酶催化功能域與CrP4H,PHD2 的活性中心比較
        4.3.3 脯氨酸3-羥化酶催化功能域膠原底物結(jié)合口袋預(yù)測
        4.3.4 脯氨酸3-羥化酶催化功能域與膠原底物結(jié)合模型
    4.4 本章討論
第五章 全文討論
參考文獻
縮略詞
附錄
致謝
學(xué)術(shù)論文和科研成果



本文編號：3943557