目的:壞死性凋亡在臟器纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用逐漸引起研究者的重視,但其在糖尿病心肌纖維化中的作用及其機制尚缺少研究。本研究目的有:1.觀察壞死性凋亡關鍵上游激酶受體相關蛋白激酶1、3(RIP1K、RIP3K)基因敲低及其抑制劑對高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞損傷和纖維化的影響,明確其作用機制與修復心臟成纖維細胞自噬流進程有關。2.研究 RIP1K 抑制劑 Nec-1、RIP3K 抑制劑 GSK872(GSK)對 RIP1K-RIP3K壞死小體的相互作用,探索低劑量Nec-1和GSK合用減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞損傷和纖維化的可行性。3.探討Nec-1對T2DM大鼠體內心肌纖維化的作用及其與自噬流的聯(lián)系。方法:體內實驗選用SD雄性大鼠,通過高糖高脂飼養(yǎng)+鏈脲佐菌素腹腔注射法制備T2DM大鼠模型;體外實驗選用原代乳鼠心臟成纖維細胞,傳代后使用25 mM葡萄糖+500 μM棕櫚酸鹽的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h建立高糖高脂誘導的心臟成纖維細胞損傷模型。通過藥理學方法(Nec-1、GSK)或基因敲低法(RIP1K knockdown、RIP3K knockdown)抑制體內、外RIP1K、...

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學位級別】：博士

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中文摘要
Abstract
前言
    一、研究背景
    二、本課題的研究內容
    三、本課題的創(chuàng)新點
    四、本課題的研究意義和價值
材料和方法
    1. 動物選擇
    2. 主要儀器和軟件
    3. 主要試劑
    4. 溶液配制
    5. 體內實驗部分
    6. 體外實驗部分
    7. 蛋白樣品制備及Western blotting步驟
    8. 流式細胞術
    9. ELISA檢測法
    10.統(tǒng)計學處理
實驗結果
    第一部分 RIP1K、RIP3K在T2DM大鼠心臟模型和高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞中表達升高
        結果
            1. 建立T2DM大鼠心臟模型
            2. 建立高糖高脂誘導的心臟成纖維細胞損傷模型
            3. RIP1K、RIP3K在糖尿病心臟成纖維細胞中表達及磷酸化激活升高
        小結
    第二部分 RIP1K、RIP3K基因敲低減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞損傷和纖維化
        結果
            1. RIP1K基因敲低抑制高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞RIP1K、p-RIP1K表達,減少心臟成纖維細胞損傷
            2. RIP1K基因敲低減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞纖維化
            3. RIP3K基因敲低抑制高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞RIP3K、p-RIP3K表達,減少心臟成纖維細胞損傷
            4. RIP3K基因敲低減少高糖培養(yǎng)下心臟成纖維細胞纖維化
        小結
    第三部分 RIP1K-RIP3K壞死小體在T2DM心肌纖維化中的機制研究
        第一節(jié) RIP1K、RIP3K基因敲低改善高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞自噬流進程和增加溶酶體膜穩(wěn)定性
            結果
                1. RIP1K基因敲低減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞LC3、P62和active-Cathepsin D表達
                2. RIP1K基因敲低改善高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞自噬流進程和增加溶酶體膜穩(wěn)定性
                3. RIP3K基因敲低減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞LC3、P62和active-Cathepsin D表達
                4. RIP3K基因敲低改善高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞自噬流進程、增加溶酶體膜穩(wěn)定性
            小結
        第二節(jié) 抑制RIP1K、RIP3K磷酸化降低高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞損傷和纖維化及其與自噬流的聯(lián)系
            結果
                1. 篩選Nec-1和GSK減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞損傷的合理濃度
                2. 自噬流阻斷劑CQ消除Nec-1、GSK減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞損傷和纖維化的作用
                3. 自噬流阻斷劑CQ消除Nec-1和GSK改善高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞自噬流進程和增加溶酶體膜穩(wěn)定性的作用
                4. 低濃度DMSO未對高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞蛋白表達產(chǎn)生影響
            小結
        第三節(jié) RIP1K、RIP3K信號相互調節(jié)通過調控自噬流減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞損傷和纖維化
            結果
                1. 基因敲低或藥理抑制RIP1K/RIP3K磷酸化減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞RIP1K-RIP3K相互作用
                2. 低劑量Nec-1與GSK合用減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞RIP1K、RIP3K表達
                3. 低劑量Nec-1與GSK合用減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞損傷和纖維化
                4. 低劑量Nec-1與GSK合用改善高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細胞自噬流進程
            小結
    第四部分 NEC-1長期治療減輕T2DM大鼠心肌纖維化及其與自噬流的聯(lián)系
        結果
            1. Nec-1改善T2DM大鼠生化、心臟重量指標及心臟功能參數(shù)
            2. Nec-1改善T2DM大鼠心肌纖維化及肥厚
            3. Nec-1減少T2DM大鼠心臟RIP1K、RIP3K以及自噬溶酶體標志蛋白表達
        小結
討論
結論
參考文獻
綜述
    參考文獻
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攻讀學位期間科研情況
致謝



本文編號：3898047