目的:壞死性凋亡在臟器纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用逐漸引起研究者的重視,但其在糖尿病心肌纖維化中的作用及其機(jī)制尚缺少研究。本研究目的有:1.觀察壞死性凋亡關(guān)鍵上游激酶受體相關(guān)蛋白激酶1、3(RIP1K、RIP3K)基因敲低及其抑制劑對(duì)高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞損傷和纖維化的影響,明確其作用機(jī)制與修復(fù)心臟成纖維細(xì)胞自噬流進(jìn)程有關(guān)。2.研究 RIP1K 抑制劑 Nec-1、RIP3K 抑制劑 GSK872(GSK)對(duì) RIP1K-RIP3K壞死小體的相互作用,探索低劑量Nec-1和GSK合用減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞損傷和纖維化的可行性。3.探討Nec-1對(duì)T2DM大鼠體內(nèi)心肌纖維化的作用及其與自噬流的聯(lián)系。方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選用SD雄性大鼠,通過(guò)高糖高脂飼養(yǎng)+鏈脲佐菌素腹腔注射法制備T2DM大鼠模型;體外實(shí)驗(yàn)選用原代乳鼠心臟成纖維細(xì)胞,傳代后使用25 mM葡萄糖+500 μM棕櫚酸鹽的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h建立高糖高脂誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞損傷模型。通過(guò)藥理學(xué)方法(Nec-1、GSK)或基因敲低法(RIP1K knockdown、RIP3K knockdown)抑制體內(nèi)、外RIP1K、...

【文章頁(yè)數(shù)】：119 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
前言
    一、研究背景
    二、本課題的研究?jī)?nèi)容
    三、本課題的創(chuàng)新點(diǎn)
    四、本課題的研究意義和價(jià)值
材料和方法
    1. 動(dòng)物選擇
    2. 主要儀器和軟件
    3. 主要試劑
    4. 溶液配制
    5. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分
    6. 體外實(shí)驗(yàn)部分
    7. 蛋白樣品制備及Western blotting步驟
    8. 流式細(xì)胞術(shù)
    9. ELISA檢測(cè)法
    10.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    第一部分 RIP1K、RIP3K在T2DM大鼠心臟模型和高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)升高
        結(jié)果
            1. 建立T2DM大鼠心臟模型
            2. 建立高糖高脂誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞損傷模型
            3. RIP1K、RIP3K在糖尿病心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)及磷酸化激活升高
        小結(jié)
    第二部分 RIP1K、RIP3K基因敲低減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞損傷和纖維化
        結(jié)果
            1. RIP1K基因敲低抑制高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞RIP1K、p-RIP1K表達(dá),減少心臟成纖維細(xì)胞損傷
            2. RIP1K基因敲低減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞纖維化
            3. RIP3K基因敲低抑制高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞RIP3K、p-RIP3K表達(dá),減少心臟成纖維細(xì)胞損傷
            4. RIP3K基因敲低減少高糖培養(yǎng)下心臟成纖維細(xì)胞纖維化
        小結(jié)
    第三部分 RIP1K-RIP3K壞死小體在T2DM心肌纖維化中的機(jī)制研究
        第一節(jié) RIP1K、RIP3K基因敲低改善高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞自噬流進(jìn)程和增加溶酶體膜穩(wěn)定性
            結(jié)果
                1. RIP1K基因敲低減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞LC3、P62和active-Cathepsin D表達(dá)
                2. RIP1K基因敲低改善高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞自噬流進(jìn)程和增加溶酶體膜穩(wěn)定性
                3. RIP3K基因敲低減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞LC3、P62和active-Cathepsin D表達(dá)
                4. RIP3K基因敲低改善高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞自噬流進(jìn)程、增加溶酶體膜穩(wěn)定性
            小結(jié)
        第二節(jié) 抑制RIP1K、RIP3K磷酸化降低高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞損傷和纖維化及其與自噬流的聯(lián)系
            結(jié)果
                1. 篩選Nec-1和GSK減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞損傷的合理濃度
                2. 自噬流阻斷劑CQ消除Nec-1、GSK減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞損傷和纖維化的作用
                3. 自噬流阻斷劑CQ消除Nec-1和GSK改善高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞自噬流進(jìn)程和增加溶酶體膜穩(wěn)定性的作用
                4. 低濃度DMSO未對(duì)高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響
            小結(jié)
        第三節(jié) RIP1K、RIP3K信號(hào)相互調(diào)節(jié)通過(guò)調(diào)控自噬流減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞損傷和纖維化
            結(jié)果
                1. 基因敲低或藥理抑制RIP1K/RIP3K磷酸化減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞RIP1K-RIP3K相互作用
                2. 低劑量Nec-1與GSK合用減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞RIP1K、RIP3K表達(dá)
                3. 低劑量Nec-1與GSK合用減少高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞損傷和纖維化
                4. 低劑量Nec-1與GSK合用改善高糖高脂培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞自噬流進(jìn)程
            小結(jié)
    第四部分 NEC-1長(zhǎng)期治療減輕T2DM大鼠心肌纖維化及其與自噬流的聯(lián)系
        結(jié)果
            1. Nec-1改善T2DM大鼠生化、心臟重量指標(biāo)及心臟功能參數(shù)
            2. Nec-1改善T2DM大鼠心肌纖維化及肥厚
            3. Nec-1減少T2DM大鼠心臟RIP1K、RIP3K以及自噬溶酶體標(biāo)志蛋白表達(dá)
        小結(jié)
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
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