目的1.利用高通量測序結(jié)合臨床大數(shù)據(jù)分析肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)病人不同疾病進程中腸道菌群及腸型差異,在微生物層面篩選HCC標志物,建立特有預(yù)測模型從微生物組學水平評估HCC病人的預(yù)后。2.探索構(gòu)建模型中高權(quán)重蛋白——纖維蛋白原γ鏈(FGG)在HCC疾病進程中的臨床意義和生物學作用方法1.采集健康人(n=20例)和HCC病人術(shù)前(n=91例)、術(shù)后(n=82例)、術(shù)后復(fù)發(fā)(n=15例)的糞便樣本,利用二代測序技術(shù)檢測腸道菌群中的16srRNA序列,結(jié)合生物信息學方法篩選HCC不同疾病進程中發(fā)生高頻改變的腸道菌屬和腸型變化。利用統(tǒng)計學方法分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。2.以第一部分研究入組病人為研究對象,借助HCC臨床大數(shù)據(jù)平臺采集臨床變量信息,構(gòu)建全維度數(shù)據(jù)集,以基于機器學習理論的XGBoost算法構(gòu)建HCC術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風險預(yù)測模型1(簡稱模型1);結(jié)合二元邏輯回歸算法對全維度臨床變量進行降維以構(gòu)建降維數(shù)據(jù)集,同前法使用降維數(shù)據(jù)集構(gòu)建模型2;將腸型分類變量納入降維數(shù)據(jù)集生成綜合數(shù)據(jù)集,同前法使用綜合數(shù)據(jù)集構(gòu)建模型3。通過預(yù)測準確率、ROC...

【文章頁數(shù)】：163 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中英文縮略詞
中文摘要
ABSTRACT
前言
    參考文獻
第一部分 應(yīng)用二代測序技術(shù)分析肝癌疾病進程中腸道菌群改變
    引言
    材料與方法
        1.研究對象
        2.臨床資料收集及隨訪情況
            2.1 臨床病理資料收集
            2.2 隨訪情況
        3.糞便樣本采集
        4.主要儀器和試劑
            4.1 儀器
            4.2 試劑
        5.核酸抽提
        6.腸道菌群16S rRNA測序
            6.1 DNA質(zhì)檢
                6.1.1 實驗準備
                6.1.2 配制檢測工作液
                6.1.3 配制待檢樣品
                6.1.4 檢測
            6.2 文庫構(gòu)建
            6.3 文庫質(zhì)檢
            6.4 測序
        7.生物信息學分析
        8.統(tǒng)計學處理
    結(jié)果
        1.樣本特征及分組
        2.Alpha多樣性分析
        3.Beta多樣性分析
        4.健康人群與HCC不同病程的菌群不同分類水平的相對豐度分析
            4.1 門水平物種分布特征
            4.2 綱水平物種分布特征
            4.3 目水平物種分布特征
            4.4 科水平物種分布特征
            4.5 屬水平物種分布特征
        5.差異物種篩選
            5.1 健康對照組vs肝癌術(shù)前組
                5.1.1 Lefse分析
                5.1.2 基于物種絕對豐度分析
            5.2 肝癌術(shù)前組vs肝癌術(shù)后組
                5.2.1 lefse分析
                5.2.2 基于物種絕對豐度分析
            5.3 肝癌術(shù)前組vs肝癌術(shù)后組vs肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)組
                5.3.1 配對樣本差異物種篩選
                5.3.2 篩選差異物種的豐度變化
        6.HCC病人術(shù)前術(shù)后腸型分析
        7.根據(jù)腸型分類區(qū)分的HCC亞組分析
            7.1 腸型分類與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)分析
            7.2 腸型分類與肝癌病人預(yù)后的關(guān)系
    討論
    小結(jié)
    參考文獻
第二部分 基于XGBOOST算法構(gòu)建并優(yōu)化數(shù)學模型評估腸型分類在肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測中的價值
    引言
    資料與方法
        1.研究對象
        2.研究目標
        3.基于大數(shù)據(jù)方法學的臨床數(shù)據(jù)挖掘及預(yù)處理
            3.1 數(shù)據(jù)來源
            3.2 數(shù)據(jù)挖掘
            3.3 獲取全維度臨床數(shù)據(jù)集
            3.4 篩選術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)變量以獲取降維數(shù)據(jù)集
                3.4.1 降維的需要
                3.4.2 二元邏輯回歸算法介紹
                3.4.3 獲取降維數(shù)據(jù)集
            3.5 綜合數(shù)據(jù)集獲取
        4.XGBoost算法及預(yù)測模型構(gòu)建
        5.預(yù)測模型評價指標選擇
    結(jié)果
        1.參與建模病例及訓練集與測試集劃分
        2.HCC術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風險預(yù)測模型構(gòu)建
        3.預(yù)測模型評價
            3.1 模型預(yù)測準確率比較
            3.2 ROC曲線及AUC值比較
        4.變量權(quán)重排序
    討論
    小結(jié)
    參考文獻
第三部分 FGG通過激活EMT增強肝細胞癌的侵襲、遷移
    引言
    材料與方法
        1.標本
            1.1 細胞株
            1.2 組織樣品采集
            1.3 各項臨床病理診斷標準的確定
            1.4 臨床病理學資料的收集
            1.5 隨訪方法
        2.主要試劑和耗材
        3.主要儀器
        4.實驗方法
            4.1 RT-qPCR檢測FGG mRNA的表達
                4.1.1 總RNA提取
                4.1.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
                4.1.3 RT-qPCR
            4.2 Western Blot實驗檢測FGG蛋白的表達
                4.2.1 總蛋白的抽提
                4.2.2 蛋白濃度的測定
                4.2.3 蛋白的變性
                4.2.4 SDS-PAGE電泳
                4.2.5 蛋白轉(zhuǎn)膜
                4.2.6 免疫反應(yīng)
                4.2.7 顯影
            4.3 免疫組化實驗檢測組織中FGG蛋白表達
                4.3.1 ElivisionTM plus二步法免疫組織化學法檢測FGG蛋白表達
                4.3.2 免疫組化結(jié)果判斷
            4.4 細胞培養(yǎng)
                4.4.1 細胞復(fù)蘇
                4.4.2 細胞傳代
                4.4.3 細胞的凍存
            4.5 質(zhì)粒構(gòu)建以及FGG穩(wěn)定過表達細胞系的建立
                4.5.1 過表達的目的細胞株
                4.5.2 載體
                4.5.3 FGG全長引物設(shè)計
                4.5.4 質(zhì)粒構(gòu)建
                4.5.5 慢病毒包裝及濃縮
                4.5.6 慢病毒感染細胞,構(gòu)建穩(wěn)定細胞株
                4.5.7 FGG穩(wěn)定過表達細胞株的鑒定
            4.6 FGG基因表達沉默細胞株構(gòu)建
                4.6.1 SiRNA的設(shè)計與合成
                4.6.2 細胞轉(zhuǎn)染
                4.6.3 siRNA沉默效率驗證
            4.7 細胞劃痕實驗
            4.8 細胞遷移和侵襲實驗
                4.8.1 侵襲小室的制備
                4.8.2 細胞懸液的制備及侵襲實驗
                4.8.3 細胞遷移實驗
            4.9 檢測EMT相關(guān)蛋白表達水平
            4.10 Slug、ZEB-1 表達沉默及表型驗證
                4.10.1 制備Slug、ZEB-1 表達沉默的細胞株
                4.10.2 聯(lián)合轉(zhuǎn)染細胞株分組
                4.10.3 細胞表型鑒定
            4.11 ELISA檢測過表達FGG的 SK-HEP-1 細胞上清液
            4.12 統(tǒng)計學分析
    結(jié)果
        1.肝癌組織中FGG表達高于癌旁肝組織
            1.1 Western Blot比較FGG蛋白表達水平
            1.2 RT-qPCR比較FGG mRNA表達水平
        2.FGG高表達與肝癌病人更具侵襲性的臨床病理特征及不良預(yù)后相關(guān)
            2.1 免疫組化檢測FGG表達
            2.2 FGG表達與臨床病理特征的相關(guān)性分析
            2.3 FGG高表達與肝癌病人不良預(yù)后相關(guān)
        3.FGG過表達促進HCC的體外遷移和侵襲能力
        4.FGG表達沉默抑制HCC的體外遷移和侵襲能力
        5.FGG可誘導(dǎo)HCC細胞發(fā)生EMT
        6.Slug、ZEB-1對FGG調(diào)控HCC細胞遷移侵襲能力的影響
        7.過表達FGG的SK-Hep-1細胞的胞外FGG水平未上調(diào)
    討論
    小結(jié)
    參考文獻
綜述
    參考文獻
致謝



本文編號：3857063