發(fā)布時(shí)間：2023-08-01 19:45

　　在過去的幾十年內(nèi),由于生活方式的巨大變化,非酒精性脂肪肝炎(NASH)已成為目前全球最為常見的慢性肝臟疾病。NASH正迅速成為肝臟移植以及肝癌(HCC)的重要誘因,也是心血管疾病(CVDs)的高危因素。NASH發(fā)病率的急劇持續(xù)增長(zhǎng)給個(gè)人及社會(huì)都造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于缺乏有效的藥物治療,NASH造成的社會(huì)負(fù)擔(dān)將會(huì)繼續(xù)攀升,迫切需要在分子機(jī)制和藥物研發(fā)方面開展研究。在所有NASH患者中,不同個(gè)體的致病因素因其所處地域或種族的不同存在很大差異,NASH發(fā)生發(fā)展期間的復(fù)雜機(jī)制無疑給研發(fā)NASH有效治療手段帶來了巨大挑戰(zhàn)。凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)是絲裂原活化蛋白3激酶家族的成員,它是NASH發(fā)生中一個(gè)重要的激活因子。在代謝應(yīng)激下,ASK1的持續(xù)性激活能夠通過JNK1/2-p38信號(hào)通路促進(jìn)肝臟炎癥和纖維化進(jìn)展。因此,抑制ASK1的活化已成為NASH治療藥物開發(fā)的主要靶點(diǎn)。多年研究發(fā)現(xiàn),ASK1抑制劑GS4997可以通過非選擇性抑制ASK1磷酸化激活對(duì)NASH發(fā)揮治療作用,然而其III期臨床治療效果并不理想。我們推斷,在保持其正常功能情況下,ASK1活性的最優(yōu)調(diào)控有望成為NASH治療的靶點(diǎn)...

【文章頁(yè)數(shù)】：137 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫符號(hào)
第一章 前言
    1 非酒精性脂肪肝研究進(jìn)展
        1.1 流行病學(xué)
        1.2 發(fā)病機(jī)制
            1.2.1 脂肪酸的合成與降解
            1.2.2 胰島素抵抗(IR)
            1.2.3 氧化應(yīng)激
            1.2.4 代謝綜合征
            1.2.5 纖維化
                1.2.5.1 肝臟纖維化的機(jī)制
                1.2.5.2 肝細(xì)胞對(duì)HSCs活化的調(diào)控作用
            1.2.6 微生物
        1.3 NASH治療方案及臨床研究進(jìn)展
            1.3.1 代謝靶點(diǎn)相關(guān)藥物
                1.3.1.1 法尼酯 X 受體(FXR)激動(dòng)劑
                1.3.1.2 過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)激動(dòng)劑
                1.3.1.3 FGF19和FGF21 類似物
                1.3.1.4 乙酰輔酶 A 羧化酶(ACC)抑制劑和硬脂酰輔酶 A 去飽和酶-1(SCD-1)抑制劑
                1.3.1.5 甲狀腺激素受體-β(THR-β)激動(dòng)劑
            1.3.2 細(xì)胞應(yīng)激、凋亡及纖維化靶點(diǎn)相關(guān)藥物
                1.3.2.1 泛半胱天冬酶(pan-caspase)抑制劑
                1.3.2.2 細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1(ASK1)抑制劑
                1.3.2.3 半乳糖凝集素-3(Galectin-3)抑制劑
                1.3.2.4 賴氨酰氧化酶樣 2(LOXL2)抗體
            1.3.3 CCR2和CCR5 拮抗劑
            1.3.4 聯(lián)合治療
    2 凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1(ASK1)
        2.1 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路
        2.2 ASK家族及分子結(jié)構(gòu)
        2.3 ASK1 活性調(diào)控機(jī)制
            2.3.1 ASK1 二聚化
                2.3.1.1 Trx
                2.3.1.2 TRAF家族
                2.3.1.3ASK2
            2.3.2 翻譯后修飾(PTMs)調(diào)控
                2.3.2.1 磷酸化修飾
                2.3.2.2 泛素化修飾
            2.3.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        2.4 應(yīng)激下的ASK1
            2.4.1 氧化應(yīng)激
            2.4.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激
        2.5 ASK1 參與調(diào)控天然免疫反應(yīng)
        2.6 ASK1 相關(guān)疾病
    3 TRAFS家族成員
        3.1 TRAFs分子的結(jié)構(gòu)與功能
        3.2 TRAFs參與信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)
            3.2.1 TRAFs與 TNF-R信號(hào)通路
            3.2.2 TRAFs與 TLR信號(hào)通路
        3.3 TRAFs與人類疾病
            3.3.1 TRAFs敲除小鼠模型
            3.3.2 TRAFs與動(dòng)脈粥樣硬化
            3.3.3 TRAFs與心肌肥厚
            3.3.4 TRAFs與肝臟糖代謝
            3.3.5 TRAFs與非酒精性脂肪肝炎
    4 本研究目的及意義
第二章 材料與方法
    1 主要實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 動(dòng)物飼料
        1.3 細(xì)胞系
        1.4 人體肝臟組織樣本
    2 儀器設(shè)備
    3 主要試劑
        3.1 抗體
        3.2 試劑盒
        3.3 試劑耗材
        3.4 溶液及緩沖液配方
    4 病毒
    5 質(zhì)粒
    6 引物序列
        6.1 qPCR所用引物序列
        6.2 質(zhì)粒構(gòu)建所用引物序列
    7 主要實(shí)驗(yàn)方法
        7.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
        7.2 組織病理學(xué)分析
            7.2.1 組織脫水包埋
            7.2.2 石蠟切片H&E染色
            7.2.3 冰凍切片油紅O染色
            7.2.4 石蠟切片PSR染色
            7.2.5 石蠟切片免疫組化
            7.2.6 石蠟切片免疫熒光染色
        7.3 小鼠血清細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)
        7.4 小鼠血清肝臟脂質(zhì)分析
        7.5 動(dòng)物原代細(xì)胞分離
            7.5.1 小鼠原代肝細(xì)胞分離
            7.5.2 小鼠肝臟炎癥細(xì)胞分離
            7.5.3 大鼠原代HSCs分離
        7.6 免疫共沉淀分析
        7.7 外源泛素化修飾檢測(cè)
        7.8 體外泛素化實(shí)驗(yàn)
        7.9 蛋白免疫印跡
            7.9.1 蛋白樣品制備
            7.9.2 SDS-PAGE電泳
            7.9.3 轉(zhuǎn)膜
            7.9.4 封閉及雜交
            7.9.5 顯影
        7.10 qPCR分析
            7.10.1 總mRNA提取
            7.10.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR
            7.10.3 qPCR
        7.11 分子克隆-基因點(diǎn)突變質(zhì)粒構(gòu)建方法
        7.12 GST pull-down
            7.12.1 GST標(biāo)簽蛋白純化
            7.12.2 Flag標(biāo)簽蛋白純化
            7.12.3 Pull-down
        7.13 熒光素酶檢測(cè)技術(shù)
            7.13.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
            7.13.2 雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)
        7.14 基因特異性敲除細(xì)胞系構(gòu)建-CRISPR-cas9 技術(shù)
            7.14.1 sgRNA篩選
            7.14.2 基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建
            7.14.3 敲除細(xì)胞系鑒定
        7.15 基因穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建
        7.16 細(xì)胞免疫熒光分析
        7.17 細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn)
        7.18 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第三章 結(jié)果與分析
    1 代謝應(yīng)激作用下肝細(xì)胞ASK1 對(duì)炎癥及纖維化反應(yīng)影響
        1.1 高度活化的ASK1 可促進(jìn)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)
        1.2 ASK1 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞炎癥可加速HSCs活化
    2 TRAF6 通過激活A(yù)SK1 促進(jìn)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)
        2.1 TRAF6 是肝細(xì)胞中ASK1 活性的關(guān)鍵激活因子
        2.2 TRAF6與ASK1 在肝細(xì)胞中具有相互作用
        2.3 TRAF6 通過激活A(yù)SK1-JNK1/2-p38 信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)
    3 TRAF6 通過激活A(yù)SK1 促進(jìn)HSCS活化
    4 TRAF6 通過介導(dǎo)ASK1-K6 泛素化修飾發(fā)揮功能
        4.1 肝細(xì)胞中TRAF6 誘導(dǎo)ASK1 發(fā)生K6 泛素化修飾
        4.2 肝細(xì)胞中TRAF6 通過ASK1-K6 泛素化促進(jìn)ASK1 活化
        4.3 ASK1-K6 泛素化對(duì)于激活A(yù)SK1 以及HSCs活化是必需的
    5 TRAF6 影響NASH的發(fā)生發(fā)展
        5.1 NASH進(jìn)展中TRAF6 在肝細(xì)胞中特異性表達(dá)上調(diào)
        5.2 TRAF6 敲低可減輕HFHC喂養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥和纖維化
        5.3 肝臟過表達(dá)TRAF6 能夠加重HFHC喂養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥和纖維化
第四章 討論
    1 抑制ASK1是NASH治療的主要分子靶點(diǎn)
    2 TRAF6 通過激活A(yù)SK1 促進(jìn)NASH發(fā)生發(fā)展
    3 TRAF6 通過介導(dǎo)ASK1-K6 泛素化調(diào)控NASH發(fā)生發(fā)展
    4 研究展望
參考文獻(xiàn)
攻博期間發(fā)表的科研成果目錄
致謝



本文編號(hào)：3838242