糖鞘脂是一類含有親脂性神經(jīng)酰胺尾部和親水性寡糖基頭部、廣泛分布于細(xì)胞膜表面的糖脂。GM1是一種含有唾液酸的糖鞘脂,具有維持細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài),調(diào)控細(xì)胞增殖、粘附、識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)等重要作用,另外還參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展。然而,GM1對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控作用和相關(guān)分子機(jī)制仍不清楚。因此,研究GM1對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖和遷移的影響,有助于深入了解GM1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為乳腺癌的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本課題以乳腺上皮細(xì)胞為研究對(duì)象,分析外源添加和內(nèi)源改變GM1對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響,提出GM1調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞增殖和遷移的可能機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:(1)外源添加GM1能夠抑制乳腺上皮細(xì)胞在高密度時(shí)的細(xì)胞增殖。通過EdU細(xì)胞增殖、Western blot和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)證實(shí)在高密度時(shí),乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、BT-549和SK-BR-3存在接觸抑制生長現(xiàn)象。流式細(xì)胞術(shù)和薄層層析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在高密度時(shí)GM1表達(dá)顯著升高。外源添加GM1能抑制高密度細(xì)胞增殖,抑制EGFR信號(hào)通路激活,但對(duì)常規(guī)密度細(xì)胞增殖沒有影響。(2)內(nèi)源過表達(dá)GM1能夠抑制乳腺上皮細(xì)胞...

【文章頁數(shù)】：128 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 前言
    1.2 糖鞘脂概述
        1.2.1 糖鞘脂的發(fā)現(xiàn)和歷史
        1.2.2 糖鞘脂的結(jié)構(gòu)和命名
        1.2.3 糖鞘脂的分布和功能
        1.2.4 糖鞘脂在癌癥中的表達(dá)與功能
    1.3 乳腺癌概述
        1.3.1 乳腺癌發(fā)展現(xiàn)狀
        1.3.2 乳腺癌分類
        1.3.3 乳腺癌與糖鞘脂
    1.4 細(xì)胞接觸抑制概述
        1.4.1 接觸抑制的發(fā)現(xiàn)和歷史
        1.4.2 接觸抑制的機(jī)理
    1.5 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化概述
        1.5.1 EMT過程和作用
        1.5.2 EMT相關(guān)信號(hào)通路
    1.6 外泌體概述
        1.6.1 外泌體的結(jié)構(gòu)和形成
        1.6.2 外泌體與細(xì)胞遷移
    1.7 本課題的立體依據(jù)及主要研究?jī)?nèi)容
        1.7.1 立體依據(jù)及研究意義
        1.7.2 主要研究?jī)?nèi)容
第二章 外源添加糖鞘脂GM1對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 主要試劑
        2.2.2 主要儀器
        2.2.3 試劑配置
        2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.5 細(xì)胞復(fù)蘇
        2.2.6 細(xì)胞傳代
        2.2.7 細(xì)胞凍存
        2.2.8 人乳腺上皮細(xì)胞生長曲線檢測(cè)
        2.2.9 EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)
        2.2.10 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)(Western blot)
        2.2.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GM1 含量
        2.2.12 總糖鞘脂的提取與薄層層析檢測(cè)
        2.2.13 外源添加GM1 處理細(xì)胞
        2.2.14 EGF刺激細(xì)胞激活EGFR信號(hào)通路
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 人乳腺上皮細(xì)胞增殖檢測(cè)
        2.3.2 常規(guī)密度和高密度細(xì)胞增殖檢測(cè)
        2.3.3 常規(guī)密度和高密度細(xì)胞EGFR信號(hào)通路檢測(cè)
        2.3.4 常規(guī)密度和高密度細(xì)胞中GM1 的表達(dá)檢測(cè)
        2.3.5 外源添加GM1 對(duì)細(xì)胞增殖的影響
        2.3.6 外源添加GM1對(duì)EGFR信號(hào)通路的影響
        2.3.7 外源添加GM1對(duì)EGFR信號(hào)通路激活的影響
    2.4 本章小結(jié)
第三章 內(nèi)源性改變GM1表達(dá)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 主要試劑
        3.2.2 主要儀器
        3.2.3 試劑配置
        3.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.5 細(xì)胞總RNA提取
        3.2.6 cDNA合成
        3.2.7 PCR及質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.8 B3GALT4 干擾載體構(gòu)建
        3.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        3.2.10 細(xì)胞株構(gòu)建
        3.2.11 Western blot蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)
        3.2.12 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GM1或Gg4 含量
        3.2.13 薄層層析免疫印跡檢測(cè)
        3.2.14 EGF刺激細(xì)胞激活EGFR信號(hào)通路
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 B3GALT4 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 GM1 過表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建
        3.3.3 檢測(cè)GM1 過表達(dá)細(xì)胞株中Gg4 的表達(dá)
        3.3.4 B3GALT4 慢病毒干擾質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.5 GM1 敲低細(xì)胞株的構(gòu)建
        3.3.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖能力檢測(cè)
        3.3.7 轉(zhuǎn)染細(xì)胞EGFR信號(hào)通路檢測(cè)
        3.3.8 轉(zhuǎn)染細(xì)胞EGFR信號(hào)通路激活檢測(cè)
    3.4 本章小結(jié)
第四章 GM1 通過改變EGFR在脂筏中的分布調(diào)控細(xì)胞增殖
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 主要試劑
        4.2.2 主要儀器
        4.2.3 試劑配置
        4.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.5 Western blot蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)
        4.2.6 細(xì)胞脂筏區(qū)和非脂筏區(qū)蛋白分的離提取
        4.2.7 免疫共沉淀(Co-IP)
        4.2.8 OptiPrep密度梯度離心
        4.2.9 免疫熒光染色檢測(cè)
        4.2.10 MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 外源添加GM3 對(duì)細(xì)胞增殖和EGFR信號(hào)通路激活的影響
        4.3.2 封閉GM1 對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響
        4.3.3 常規(guī)密度和高密度時(shí)EGFR在脂筏區(qū)和非脂筏區(qū)的分布檢測(cè)
        4.3.4 常規(guī)密度和高密度細(xì)胞中EGFR在糖鞘脂富集區(qū)和小窩區(qū)的分布檢測(cè)
        4.3.5 EGF刺激后常規(guī)密度和高密度細(xì)胞中EGFR在細(xì)胞膜上分布檢測(cè)
        4.3.6 外源添加GM1 處理對(duì)EGFR分布的影響
        4.3.7 外源添加GM1對(duì)EGFR在糖鞘脂富集區(qū)和小窩區(qū)的分布影響
    4.4 本章小結(jié)
第五章 GM1對(duì)乳腺上皮遷移的影響
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 主要試劑
        5.2.2 主要儀器
        5.2.3 試劑配置
        5.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)
        5.2.5 Western blot蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)
        5.2.6 細(xì)胞懸滴聚集檢測(cè)
        5.2.7細(xì)胞貼壁實(shí)驗(yàn)
        5.2.8 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 敲低和過表達(dá)GM1 對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響
        5.3.2 敲低和過表達(dá)GM1 后細(xì)胞EMT marker的變化
        5.3.3 敲低和過表達(dá)GM1 后細(xì)胞粘附能力的變化
        5.3.4 敲低和過表達(dá)GM1 后對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響
        5.3.5 敲低和過表達(dá)GM1對(duì)TGF-β誘導(dǎo)發(fā)生EMT的影響
    5.4 本章小結(jié)
第六章 GM1對(duì)癌細(xì)胞來源的外泌體促進(jìn)受體細(xì)胞遷移的影響
    6.1 前言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 主要試劑
        6.2.2 主要儀器
        6.2.3 試劑配置
        6.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)
        6.2.5 流式檢測(cè)細(xì)胞GM1 的表達(dá)
        6.2.6 Western blot蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)
        6.2.7 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
        6.2.8 MDA-MB-231 細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理MCF-10A細(xì)胞
        6.2.9 MDA-MB-231和MCF-7 共培養(yǎng)體系建立
        6.2.10 MDA-MB-231 細(xì)胞來源外泌體的提取
        6.2.11 外泌體標(biāo)志物檢測(cè)
        6.2.12 外泌體粒徑檢測(cè)
        6.2.13 外泌體電鏡拍照
        6.2.14 外泌體密度梯度離心
        6.2.15 外泌體處理MCF-10A細(xì)胞
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 MDA-MB-231 細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理對(duì)受體細(xì)胞GM1 含量的影響
        6.3.2 MDA-MB-231 細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理對(duì)MCF-10A細(xì)胞EMT的影響
        6.3.3 MDA-MB-231和MCF-7 細(xì)胞共培養(yǎng)體系中MCF-7 細(xì)胞EMT變化檢測(cè)
        6.3.4 外泌體質(zhì)量檢測(cè)
        6.3.5 外泌體GM1 的表達(dá)檢測(cè)
        6.3.6 兩種細(xì)胞來源的外泌體GM1 表達(dá)差異檢測(cè)
        6.3.7 MCF-10A細(xì)胞攝入外泌體檢測(cè)
        6.3.8 外泌體處理對(duì)MCF-10A細(xì)胞EMT的影響
    6.4 本章小結(jié)
主要結(jié)論與展望
論文創(chuàng)新點(diǎn)
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄:作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文



本文編號(hào)：3798698