糖鞘脂是一類含有親脂性神經(jīng)酰胺尾部和親水性寡糖基頭部、廣泛分布于細胞膜表面的糖脂。GM1是一種含有唾液酸的糖鞘脂,具有維持細胞膜穩(wěn)態(tài),調(diào)控細胞增殖、粘附、識別和信號傳導(dǎo)等重要作用,另外還參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展。然而,GM1對乳腺上皮細胞增殖和遷移的調(diào)控作用和相關(guān)分子機制仍不清楚。因此,研究GM1對乳腺上皮細胞增殖和遷移的影響,有助于深入了解GM1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為乳腺癌的治療提供實驗基礎(chǔ)。本課題以乳腺上皮細胞為研究對象,分析外源添加和內(nèi)源改變GM1對細胞增殖和遷移的影響,提出GM1調(diào)控乳腺上皮細胞增殖和遷移的可能機制。主要研究結(jié)果如下:(1)外源添加GM1能夠抑制乳腺上皮細胞在高密度時的細胞增殖。通過EdU細胞增殖、Western blot和流式細胞術(shù)等實驗證實在高密度時,乳腺上皮細胞MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、BT-549和SK-BR-3存在接觸抑制生長現(xiàn)象。流式細胞術(shù)和薄層層析檢測發(fā)現(xiàn)細胞在高密度時GM1表達顯著升高。外源添加GM1能抑制高密度細胞增殖,抑制EGFR信號通路激活,但對常規(guī)密度細胞增殖沒有影響。(2)內(nèi)源過表達GM1能夠抑制乳腺上皮細胞...

【文章頁數(shù)】：128 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 前言
    1.2 糖鞘脂概述
        1.2.1 糖鞘脂的發(fā)現(xiàn)和歷史
        1.2.2 糖鞘脂的結(jié)構(gòu)和命名
        1.2.3 糖鞘脂的分布和功能
        1.2.4 糖鞘脂在癌癥中的表達與功能
    1.3 乳腺癌概述
        1.3.1 乳腺癌發(fā)展現(xiàn)狀
        1.3.2 乳腺癌分類
        1.3.3 乳腺癌與糖鞘脂
    1.4 細胞接觸抑制概述
        1.4.1 接觸抑制的發(fā)現(xiàn)和歷史
        1.4.2 接觸抑制的機理
    1.5 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化概述
        1.5.1 EMT過程和作用
        1.5.2 EMT相關(guān)信號通路
    1.6 外泌體概述
        1.6.1 外泌體的結(jié)構(gòu)和形成
        1.6.2 外泌體與細胞遷移
    1.7 本課題的立體依據(jù)及主要研究內(nèi)容
        1.7.1 立體依據(jù)及研究意義
        1.7.2 主要研究內(nèi)容
第二章 外源添加糖鞘脂GM1對乳腺上皮細胞增殖的影響
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 主要試劑
        2.2.2 主要儀器
        2.2.3 試劑配置
        2.2.4 細胞培養(yǎng)
        2.2.5 細胞復(fù)蘇
        2.2.6 細胞傳代
        2.2.7 細胞凍存
        2.2.8 人乳腺上皮細胞生長曲線檢測
        2.2.9 EdU細胞增殖檢測
        2.2.10 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(Western blot)
        2.2.11 流式細胞術(shù)檢測GM1 含量
        2.2.12 總糖鞘脂的提取與薄層層析檢測
        2.2.13 外源添加GM1 處理細胞
        2.2.14 EGF刺激細胞激活EGFR信號通路
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 人乳腺上皮細胞增殖檢測
        2.3.2 常規(guī)密度和高密度細胞增殖檢測
        2.3.3 常規(guī)密度和高密度細胞EGFR信號通路檢測
        2.3.4 常規(guī)密度和高密度細胞中GM1 的表達檢測
        2.3.5 外源添加GM1 對細胞增殖的影響
        2.3.6 外源添加GM1對EGFR信號通路的影響
        2.3.7 外源添加GM1對EGFR信號通路激活的影響
    2.4 本章小結(jié)
第三章 內(nèi)源性改變GM1表達對乳腺上皮細胞增殖的影響
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 主要試劑
        3.2.2 主要儀器
        3.2.3 試劑配置
        3.2.4 細胞培養(yǎng)
        3.2.5 細胞總RNA提取
        3.2.6 cDNA合成
        3.2.7 PCR及質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.8 B3GALT4 干擾載體構(gòu)建
        3.2.9 實時熒光定量PCR
        3.2.10 細胞株構(gòu)建
        3.2.11 Western blot蛋白質(zhì)免疫印跡檢測
        3.2.12 流式細胞術(shù)檢測GM1或Gg4 含量
        3.2.13 薄層層析免疫印跡檢測
        3.2.14 EGF刺激細胞激活EGFR信號通路
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 B3GALT4 慢病毒表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 GM1 過表達細胞株的構(gòu)建
        3.3.3 檢測GM1 過表達細胞株中Gg4 的表達
        3.3.4 B3GALT4 慢病毒干擾質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.5 GM1 敲低細胞株的構(gòu)建
        3.3.6 轉(zhuǎn)染細胞增殖能力檢測
        3.3.7 轉(zhuǎn)染細胞EGFR信號通路檢測
        3.3.8 轉(zhuǎn)染細胞EGFR信號通路激活檢測
    3.4 本章小結(jié)
第四章 GM1 通過改變EGFR在脂筏中的分布調(diào)控細胞增殖
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 主要試劑
        4.2.2 主要儀器
        4.2.3 試劑配置
        4.2.4 細胞培養(yǎng)
        4.2.5 Western blot蛋白質(zhì)免疫印跡檢測
        4.2.6 細胞脂筏區(qū)和非脂筏區(qū)蛋白分的離提取
        4.2.7 免疫共沉淀(Co-IP)
        4.2.8 OptiPrep密度梯度離心
        4.2.9 免疫熒光染色檢測
        4.2.10 MTS檢測細胞增殖
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 外源添加GM3 對細胞增殖和EGFR信號通路激活的影響
        4.3.2 封閉GM1 對細胞增殖能力的影響
        4.3.3 常規(guī)密度和高密度時EGFR在脂筏區(qū)和非脂筏區(qū)的分布檢測
        4.3.4 常規(guī)密度和高密度細胞中EGFR在糖鞘脂富集區(qū)和小窩區(qū)的分布檢測
        4.3.5 EGF刺激后常規(guī)密度和高密度細胞中EGFR在細胞膜上分布檢測
        4.3.6 外源添加GM1 處理對EGFR分布的影響
        4.3.7 外源添加GM1對EGFR在糖鞘脂富集區(qū)和小窩區(qū)的分布影響
    4.4 本章小結(jié)
第五章 GM1對乳腺上皮遷移的影響
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 主要試劑
        5.2.2 主要儀器
        5.2.3 試劑配置
        5.2.4 細胞培養(yǎng)
        5.2.5 Western blot蛋白質(zhì)免疫印跡檢測
        5.2.6 細胞懸滴聚集檢測
        5.2.7細胞貼壁實驗
        5.2.8 Transwell細胞遷移實驗
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 敲低和過表達GM1 對細胞形態(tài)的影響
        5.3.2 敲低和過表達GM1 后細胞EMT marker的變化
        5.3.3 敲低和過表達GM1 后細胞粘附能力的變化
        5.3.4 敲低和過表達GM1 后對細胞遷移能力的影響
        5.3.5 敲低和過表達GM1對TGF-β誘導(dǎo)發(fā)生EMT的影響
    5.4 本章小結(jié)
第六章 GM1對癌細胞來源的外泌體促進受體細胞遷移的影響
    6.1 前言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 主要試劑
        6.2.2 主要儀器
        6.2.3 試劑配置
        6.2.4 細胞培養(yǎng)
        6.2.5 流式檢測細胞GM1 的表達
        6.2.6 Western blot蛋白質(zhì)免疫印跡檢測
        6.2.7 Transwell細胞遷移實驗
        6.2.8 MDA-MB-231 細胞條件培養(yǎng)基處理MCF-10A細胞
        6.2.9 MDA-MB-231和MCF-7 共培養(yǎng)體系建立
        6.2.10 MDA-MB-231 細胞來源外泌體的提取
        6.2.11 外泌體標(biāo)志物檢測
        6.2.12 外泌體粒徑檢測
        6.2.13 外泌體電鏡拍照
        6.2.14 外泌體密度梯度離心
        6.2.15 外泌體處理MCF-10A細胞
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 MDA-MB-231 細胞條件培養(yǎng)基處理對受體細胞GM1 含量的影響
        6.3.2 MDA-MB-231 細胞條件培養(yǎng)基處理對MCF-10A細胞EMT的影響
        6.3.3 MDA-MB-231和MCF-7 細胞共培養(yǎng)體系中MCF-7 細胞EMT變化檢測
        6.3.4 外泌體質(zhì)量檢測
        6.3.5 外泌體GM1 的表達檢測
        6.3.6 兩種細胞來源的外泌體GM1 表達差異檢測
        6.3.7 MCF-10A細胞攝入外泌體檢測
        6.3.8 外泌體處理對MCF-10A細胞EMT的影響
    6.4 本章小結(jié)
主要結(jié)論與展望
論文創(chuàng)新點
致謝
參考文獻
附錄:作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文



本文編號：3798698