該博士學(xué)位論文由相互聯(lián)系的三部分內(nèi)容組成。第一部分:絨毛特異性基因蘊(yùn)藏了人類多種癌癥的預(yù)后分子標(biāo)志物背景:腫瘤的發(fā)生發(fā)展與胎盤的發(fā)育有很多相似的生物學(xué)行為,但兩者之間的關(guān)系尚未得到很好的探索。絨毛是胎盤發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期,涉及許多生物學(xué)過程,如滋養(yǎng)層細(xì)胞活躍的分裂增殖能力,逃避母體的免疫排斥,植入到子宮蛻膜及肌層等。而腫瘤細(xì)胞可能劫持了滋養(yǎng)層細(xì)胞的特性,兩者有很多相似的生物學(xué)行為。目的:通過比較正常妊娠人工流產(chǎn)術(shù)后絨毛組織和成熟胎盤葉狀絨毛膜組織的變化,探討腫瘤的相應(yīng)特征,為腫瘤研究提供新的途徑,尋找新的癌癥診斷和治療靶點(diǎn)。方法:收集36例正常妊娠人工流產(chǎn)術(shù)后的絨毛組織和8例成熟胎盤的葉狀絨毛膜組織,進(jìn)行了全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)。結(jié)合The Cancer Genome Atlas(TCGA,癌癥基因組圖譜)泛癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)的方法鑒定出早期絨毛特異性表達(dá)基因,并通過GO以及KEGG富集分析,觀察其主要參與的生物學(xué)功能和通路,最后確定這些特異性基因在泛癌中的改變并且評(píng)估與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:首先,通過與成熟胎盤葉狀絨毛膜組織相比,我們鑒定出237個(gè)在早期絨毛組織中特異性表...

【文章頁數(shù)】：154 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中英文縮略詞
中文摘要
ABSTRACT
第一部分 絨毛特異性基因蘊(yùn)藏了人類多種癌癥的預(yù)后分子標(biāo)志物
    前言
    材料與方法
        1. 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 胎盤絨毛和成熟胎盤葉狀絨毛膜組織的樣本收集
            1.2 獲取TCGA公共數(shù)據(jù)
            1.3 主要的試劑與試劑盒
            1.4 主要儀器與耗材
            1.5 生物信息學(xué)分析軟件及網(wǎng)站
        2. 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 總RNA的提取及純化
            2.2 總RNA的濃度測(cè)定和質(zhì)控
            2.3 AgilentmRNA表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)
                2.3.1 待標(biāo)記樣本的制備
                2.3.2 合成cDNA
                2.3.3 cRNA的合成擴(kuò)增及Cy3熒光標(biāo)記
                2.3.4 cRNA的純化及質(zhì)控
                2.3.5 雜交樣本的準(zhǔn)備及雜交
                2.3.6 芯片的清洗
                2.3.7 芯片的掃描和數(shù)據(jù)提取及質(zhì)控
            2.4 數(shù)據(jù)分析
                2.4.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理和標(biāo)準(zhǔn)化
                2.4.2 絨毛特異基因的富集分析
                2.4.3 生存分析
            2.5 數(shù)據(jù)庫的使用
    結(jié)果
        1. 表達(dá)譜芯片的總結(jié)
        2. 早期絨毛特異性表達(dá)的基因執(zhí)行不同的生物學(xué)功能
        3. 絨毛特異性基因在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)
        4. 免疫、增殖、黏附相關(guān)的絨毛特異基因與預(yù)后相關(guān)
    討論
    小結(jié)
第二部分: 利用人絨毛發(fā)育模型鑒別結(jié)直腸癌預(yù)后生物標(biāo)志物
    前言
    材料與方法
        1. 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 絨毛樣本的收集
            1.2 獲取GEO公共數(shù)據(jù)
            1.3 獲取TCGA公共數(shù)據(jù)
            1.4 細(xì)胞系
            1.5 感受態(tài)細(xì)胞
            1.6 質(zhì)粒
            1.7 主要的實(shí)驗(yàn)儀器與試劑盒及試劑
            1.8 生物信息學(xué)分析軟件及網(wǎng)站
        2. 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 樣品mRNA測(cè)序
                2.1.1 總RNA提取
                2.1.2 總RNA質(zhì)量檢測(cè)及構(gòu)建文庫
                2.1.3 上機(jī)測(cè)序
            2.2 數(shù)據(jù)分析
                2.2.1 數(shù)據(jù)清洗、序列比對(duì)及基因表達(dá)水平測(cè)定
                2.2.2 絨毛和結(jié)直腸癌中基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及富集分析
                2.2.3 根據(jù)“偏離理論”篩選基因
                2.2.4 利用廣義線性模型篩選基因
                2.2.5 生存分析
            2.3 免疫組織化學(xué)
            2.4 細(xì)胞系培養(yǎng)
                2.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇
                2.4.2 細(xì)胞傳代
                2.4.3 細(xì)胞凍存
            2.5 表達(dá)載體的擴(kuò)增
                2.5.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌
                2.5.2 大腸桿菌的擴(kuò)增
                2.5.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株
            2.6 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
            2.7 細(xì)胞RNA表達(dá)水平檢測(cè)
                2.7.1 細(xì)胞總RNA的提取
                2.7.2 Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)RNA的完整性
                2.7.3 cDNA合成
                2.7.4 實(shí)時(shí)定量PCR
            2.8 細(xì)胞蛋白表達(dá)水平檢測(cè)
                2.8.1 細(xì)胞總蛋白提取
                2.8.2 總蛋白定量
                2.8.3 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)
            2.9 細(xì)胞生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)
                2.9.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)-CCK8
                2.9.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)-細(xì)胞克隆形成
                2.9.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
                2.9.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
                2.9.5 CHPF參與調(diào)節(jié)的基因/通路
            2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    結(jié)果
        1. 早期絨毛和結(jié)直腸癌中構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及功能注釋
        2. 鑒別偏離基因
        3. 鑒別在結(jié)直腸癌變過程中連續(xù)上升或下降的基因
        4. 24個(gè)基因與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性
        5. CHPF和MMP14的蛋白表達(dá)與預(yù)后
        6. CHPF影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)表型
            6.1 CHPF通過抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡來促進(jìn)增殖
            6.2 CHPF促進(jìn)細(xì)胞的遷移
            6.3 CHPF參與的信號(hào)通路
    討論
    小結(jié)
第三部分 胎盤絨毛多組學(xué)特征基因與泛癌預(yù)后的相關(guān)性
    前言
    材料與方法
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 絨毛樣本的收集
            1.2 TCGA公共數(shù)據(jù)的獲取
            1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
            1.4 主要試劑盒及試劑
            1.5 主要溶液及配制方法
            1.6 生物信息學(xué)分析軟件及網(wǎng)站
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 樣品mRNA測(cè)序
            2.2 樣品DNA甲基化Illumina 850K芯片
                2.2.1 抽提組織DNA及純化
                2.2.2 鑒定DNA質(zhì)量
                2.2.3 亞硫酸氫鹽處理DNA樣本
                2.2.4 堿變性及基因組擴(kuò)增和片段化
                2.2.5 芯片雜交、洗脫及掃描
                2.2.6 甲基化芯片數(shù)據(jù)分析
            2.3 樣品蛋白質(zhì)譜
                2.3.1 蛋白提取、變性及酶切
                2.3.2 高精度質(zhì)譜Fusion檢測(cè)
                2.3.3 MaxQuant軟件數(shù)據(jù)搜庫
                2.3.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析
            2.4 甲基化數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)整合分析
    結(jié)果
        1. 早期絨毛的甲基化呈整體低甲基化
        2. 轉(zhuǎn)錄組與甲基化數(shù)據(jù)相關(guān)性分析
        3. 轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)相關(guān)性分析
        4. 多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析
        5. 19個(gè)組學(xué)特征基因在泛癌中表達(dá)失調(diào)并與預(yù)后相關(guān)
    討論
    小結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
基金資助
已發(fā)表與學(xué)位論文相關(guān)的英文論文
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3797518