目的:以人三陰性乳腺癌(TNBC)順鉑(DDP)耐藥細胞株MDA-MB-231/DDP分泌外泌體(DDP-EXO)及其攜帶micro RNA為研究切入點,深入探討TNBC順鉑耐藥可能機制及益氣小復(fù)方作用于外泌體阻滯TNBC順鉑耐藥作用,為益氣小復(fù)方逆轉(zhuǎn)耐藥提供實驗依據(jù)。方法:以三陰性乳腺癌親本細胞MDA-MB-231及其順鉑(platinum,DDP)耐藥細胞MDA-MB-231/DDP為模型,采用過濾離心法提取MDA-MB-231/DDP外泌體(DDP-EXO);透射電子顯微鏡觀察鑒定DDP-EXO形態(tài);Western blot檢測其CD63、TSG101、CD9的表達;用激光共聚焦顯微鏡追蹤DDP-EXO與野生細胞MDA-MB-231的相互作用;使用micro RNA分析MDA-MB-231/DDP和MDA-MB-231外泌體中的micro RNA表達譜篩選差異顯著micro RNA,RT-q PCR技術(shù)驗證芯片預(yù)測結(jié)果;MTT測定、流式細胞術(shù)和Transwell實驗確定外泌體micro RNA在體外對MDA-MB-231增殖、凋亡、遷移和侵襲能力影響;進一步通過MTT實驗、流式細...

【文章頁數(shù)】：115 頁

【學位級別】：博士

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中文摘要
Abstract
引言
第一部分 MDA-MB-231/DDP外泌體(DDP-EXO)的提取、鑒定及在耐藥中的作用
    1 實驗材料
        1.1 細胞株
        1.2 主要實驗試劑
        1.3 儀器與設(shè)備
        1.4 主要試劑的配制
    2 實驗方法
        2.1 基本細胞實驗
        2.2 過濾離心法提取外泌體
        2.3 順鉑制備
        2.4 外泌體電鏡觀察
        2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞對外泌體攝取
        2.6 外泌體蛋白提取及定量
        2.7 外泌體 DDP-EXO 對 MDA-MB-231 細胞增殖能力影響
        2.8 蛋白免疫印跡實驗(Western blot)
    3 統(tǒng)計方法
    4 實驗結(jié)果
        4.1 外泌體形態(tài)鑒定
        4.2 外泌體相關(guān)標志蛋白的表達
        4.3 粒徑分析
        4.4 野生細胞 MDA-MB-231 對 DDP-EXO 攝入情況
        4.5 DDP-EXO 與 MDA-MB-231 共培養(yǎng)后,耐藥指數(shù)的變化
    5 討論
    6 結(jié)論
第二部分 基于芯片技術(shù)分析MDA-MB-231/DDP外泌體耐藥相關(guān)micro RNA
    1 實驗材料
        1.1 細胞株及芯片技術(shù)
        1.2 試劑與耗材
        1.3 主要實驗儀器
    2 實驗方法
        2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2 外泌體提取及分組
        2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)
            2.3.1 mirVana^TM RNA Isolation Kit 提取細胞 Total RNA
            2.3.2 反轉(zhuǎn)錄 c DNA
            2.3.3 引物設(shè)計
            2.3.4 實時熒光定量 PCR
            2.3.5 結(jié)果分析方法
        2.4 芯片差異基因分析方法
    3 統(tǒng)計方法
    4 實驗結(jié)果
        4.1 差異 microRNA 篩選及聚類分析
        4.2 Pathway分析
        4.3 micro RNA的 RT-q PCR驗證
    5 討論
    6 結(jié)論
第三部分 外泌體mi R-423-5p對 MDA-MB-231 細胞生物學行為影響
    1 實驗材料
        1.1 細胞及藥物同實驗第二部分
        1.2 試劑與耗材
        1.3 主要儀器設(shè)備
    2 實驗方法
        2.1 細胞共培養(yǎng)
        2.2 順鉑對細胞增殖抑制作用測定
        2.3 細胞凋亡檢測
        2.4 劃痕修復(fù)能力檢測
        2.5 細胞遷移、侵襲能力檢測
        2.6 細胞轉(zhuǎn)染
    3 統(tǒng)計方法
    4 實驗結(jié)果
        4.1 DDP-EXO 對 MDA-MB-231 凋亡的影響
        4.2 DDP-EXO 對 MDA-MB-231 侵襲能力的影響
        4.3 DDP-EXO 對 MDA-MB-231 劃痕修復(fù)能力的影響
        4.4 過表達及干擾 mi R-423-5p 細胞增殖活力檢測
        4.5 過表達及干擾 mi R-423-5p 細胞凋亡能力檢測
        4.6 過表達及干擾miR-423-5p細胞劃痕修復(fù)能力檢測
        4.7 過表達及干擾miR-423-5p細胞侵襲能力檢測
        4.8 RT-q PCR檢測mi R-423-5p過表達及干擾后PTEN基因表達情況
        4.9 RT-q PCR檢測PTEN過表達及干擾后mi RNA-423-5p表達情況
    5 討論
    6 結(jié)論
第四部分 益氣小復(fù)方調(diào)控外泌體DDP-EXO中 mi R-423-5p逆轉(zhuǎn)TNBC順鉑耐藥研究
    1 實驗材料
    2 實驗方法
        2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2 實驗分組
        2.3 益氣小復(fù)方的制備
        2.4 MTT 實驗測定益氣小復(fù)方對細胞增殖抑制作用
        2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡
        2.6 劃痕實驗術(shù)檢測細胞修復(fù)能力
        2.7 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力
        2.8 RT-q PCR 檢測 miRNA-423-5p、PTEN、p-AKT 的表達
        2.9 Western blot 檢測 PTEN、PI3K、AKT 蛋白的表達
    3 統(tǒng)計方法
    4 實驗結(jié)果
        4.1 益氣小復(fù)方對 DDP-EXO 誘導(dǎo) MDA-MB-231 耐藥細胞的增殖能力影響
        4.2 益氣小復(fù)方對 DDP-EXO 誘導(dǎo) MDA-MB-231 耐藥細胞的凋亡能力影響
        4.3 益氣小復(fù)方對 DDP-EXO 誘導(dǎo) MDA-MB-231 耐藥細胞的修復(fù)能力影響
        4.4 RT-q PCR 檢測益氣小復(fù)方對 DDP-EXO 誘導(dǎo) MDA-MB-231 耐藥細胞miRNA-423-5p、PTEN、p-AKT 的表達
    5 討論
    6 結(jié)論
第五部分 益氣小復(fù)方對外泌體誘導(dǎo)耐藥移植瘤模型影響
    1 實驗材料
        1.1 細胞株和藥物
        1.2 實驗動物
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器設(shè)備
    2 實驗方法
        2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2 動物模型建立
        2.3 給藥及分組
        2.4 實驗動物體重及瘤塊體積生長變化
        2.5 藥物的抑瘤作用
        2.6 Real-time PCR 法檢測相關(guān) PI3K/AKT 信號通路基因表達
    3 統(tǒng)計方法
    4 實驗結(jié)果
        4.1 給藥期間各組實驗動物體重變化
        4.2 各組實驗動物體積及瘤重抑制率
        4.3 各組 mi RNA-423-5p、AKT、PTEN 基因表達水平
        4.4 Western blot檢測各組PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵蛋白表達
    5 討論
    6 結(jié)論
創(chuàng)新點
總結(jié)
致謝
參考文獻
附錄一:已發(fā)表文章
附錄二 :文獻綜述 外泌體介導(dǎo) mi RNA 在乳腺癌化療耐藥中的作用
    參考文獻
附錄三 已投稿待發(fā)表論文



本文編號：3793501