目的:以人三陰性乳腺癌(TNBC)順鉑(DDP)耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/DDP分泌外泌體(DDP-EXO)及其攜帶micro RNA為研究切入點(diǎn),深入探討TNBC順鉑耐藥可能機(jī)制及益氣小復(fù)方作用于外泌體阻滯TNBC順鉑耐藥作用,為益氣小復(fù)方逆轉(zhuǎn)耐藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:以三陰性乳腺癌親本細(xì)胞MDA-MB-231及其順鉑(platinum,DDP)耐藥細(xì)胞MDA-MB-231/DDP為模型,采用過濾離心法提取MDA-MB-231/DDP外泌體(DDP-EXO);透射電子顯微鏡觀察鑒定DDP-EXO形態(tài);Western blot檢測(cè)其CD63、TSG101、CD9的表達(dá);用激光共聚焦顯微鏡追蹤DDP-EXO與野生細(xì)胞MDA-MB-231的相互作用;使用micro RNA分析MDA-MB-231/DDP和MDA-MB-231外泌體中的micro RNA表達(dá)譜篩選差異顯著micro RNA,RT-q PCR技術(shù)驗(yàn)證芯片預(yù)測(cè)結(jié)果;MTT測(cè)定、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell實(shí)驗(yàn)確定外泌體micro RNA在體外對(duì)MDA-MB-231增殖、凋亡、遷移和侵襲能力影響;進(jìn)一步通過MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)...

【文章頁數(shù)】：115 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
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中文摘要
Abstract
引言
第一部分 MDA-MB-231/DDP外泌體(DDP-EXO)的提取、鑒定及在耐藥中的作用
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        1.3 儀器與設(shè)備
        1.4 主要試劑的配制
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 基本細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
        2.2 過濾離心法提取外泌體
        2.3 順鉑制備
        2.4 外泌體電鏡觀察
        2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)外泌體攝取
        2.6 外泌體蛋白提取及定量
        2.7 外泌體 DDP-EXO 對(duì) MDA-MB-231 細(xì)胞增殖能力影響
        2.8 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)
    3 統(tǒng)計(jì)方法
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 外泌體形態(tài)鑒定
        4.2 外泌體相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)
        4.3 粒徑分析
        4.4 野生細(xì)胞 MDA-MB-231 對(duì) DDP-EXO 攝入情況
        4.5 DDP-EXO 與 MDA-MB-231 共培養(yǎng)后,耐藥指數(shù)的變化
    5 討論
    6 結(jié)論
第二部分 基于芯片技術(shù)分析MDA-MB-231/DDP外泌體耐藥相關(guān)micro RNA
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 細(xì)胞株及芯片技術(shù)
        1.2 試劑與耗材
        1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 外泌體提取及分組
        2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)
            2.3.1 mirVana^TM RNA Isolation Kit 提取細(xì)胞 Total RNA
            2.3.2 反轉(zhuǎn)錄 c DNA
            2.3.3 引物設(shè)計(jì)
            2.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR
            2.3.5 結(jié)果分析方法
        2.4 芯片差異基因分析方法
    3 統(tǒng)計(jì)方法
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 差異 microRNA 篩選及聚類分析
        4.2 Pathway分析
        4.3 micro RNA的 RT-q PCR驗(yàn)證
    5 討論
    6 結(jié)論
第三部分 外泌體mi R-423-5p對(duì) MDA-MB-231 細(xì)胞生物學(xué)行為影響
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 細(xì)胞及藥物同實(shí)驗(yàn)第二部分
        1.2 試劑與耗材
        1.3 主要儀器設(shè)備
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 細(xì)胞共培養(yǎng)
        2.2 順鉑對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用測(cè)定
        2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)
        2.4 劃痕修復(fù)能力檢測(cè)
        2.5 細(xì)胞遷移、侵襲能力檢測(cè)
        2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
    3 統(tǒng)計(jì)方法
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 DDP-EXO 對(duì) MDA-MB-231 凋亡的影響
        4.2 DDP-EXO 對(duì) MDA-MB-231 侵襲能力的影響
        4.3 DDP-EXO 對(duì) MDA-MB-231 劃痕修復(fù)能力的影響
        4.4 過表達(dá)及干擾 mi R-423-5p 細(xì)胞增殖活力檢測(cè)
        4.5 過表達(dá)及干擾 mi R-423-5p 細(xì)胞凋亡能力檢測(cè)
        4.6 過表達(dá)及干擾miR-423-5p細(xì)胞劃痕修復(fù)能力檢測(cè)
        4.7 過表達(dá)及干擾miR-423-5p細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)
        4.8 RT-q PCR檢測(cè)mi R-423-5p過表達(dá)及干擾后PTEN基因表達(dá)情況
        4.9 RT-q PCR檢測(cè)PTEN過表達(dá)及干擾后mi RNA-423-5p表達(dá)情況
    5 討論
    6 結(jié)論
第四部分 益氣小復(fù)方調(diào)控外泌體DDP-EXO中 mi R-423-5p逆轉(zhuǎn)TNBC順鉑耐藥研究
    1 實(shí)驗(yàn)材料
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 實(shí)驗(yàn)分組
        2.3 益氣小復(fù)方的制備
        2.4 MTT 實(shí)驗(yàn)測(cè)定益氣小復(fù)方對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用
        2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)術(shù)檢測(cè)細(xì)胞修復(fù)能力
        2.7 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力
        2.8 RT-q PCR 檢測(cè) miRNA-423-5p、PTEN、p-AKT 的表達(dá)
        2.9 Western blot 檢測(cè) PTEN、PI3K、AKT 蛋白的表達(dá)
    3 統(tǒng)計(jì)方法
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 益氣小復(fù)方對(duì) DDP-EXO 誘導(dǎo) MDA-MB-231 耐藥細(xì)胞的增殖能力影響
        4.2 益氣小復(fù)方對(duì) DDP-EXO 誘導(dǎo) MDA-MB-231 耐藥細(xì)胞的凋亡能力影響
        4.3 益氣小復(fù)方對(duì) DDP-EXO 誘導(dǎo) MDA-MB-231 耐藥細(xì)胞的修復(fù)能力影響
        4.4 RT-q PCR 檢測(cè)益氣小復(fù)方對(duì) DDP-EXO 誘導(dǎo) MDA-MB-231 耐藥細(xì)胞miRNA-423-5p、PTEN、p-AKT 的表達(dá)
    5 討論
    6 結(jié)論
第五部分 益氣小復(fù)方對(duì)外泌體誘導(dǎo)耐藥移植瘤模型影響
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 細(xì)胞株和藥物
        1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器設(shè)備
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 動(dòng)物模型建立
        2.3 給藥及分組
        2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重及瘤塊體積生長變化
        2.5 藥物的抑瘤作用
        2.6 Real-time PCR 法檢測(cè)相關(guān) PI3K/AKT 信號(hào)通路基因表達(dá)
    3 統(tǒng)計(jì)方法
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 給藥期間各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重變化
        4.2 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體積及瘤重抑制率
        4.3 各組 mi RNA-423-5p、AKT、PTEN 基因表達(dá)水平
        4.4 Western blot檢測(cè)各組PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)
    5 討論
    6 結(jié)論
創(chuàng)新點(diǎn)
總結(jié)
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄一:已發(fā)表文章
附錄二 :文獻(xiàn)綜述 外泌體介導(dǎo) mi RNA 在乳腺癌化療耐藥中的作用
    參考文獻(xiàn)
附錄三 已投稿待發(fā)表論文



本文編號(hào)：3793501