本文關(guān)鍵詞：E1A激活基因阻遏子抑制小鼠巨噬細(xì)胞炎癥的自噬-溶酶體調(diào)控機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的心血管疾病是全球死亡率的主要病因。脂質(zhì)功能失調(diào)、動(dòng)脈脂質(zhì)聚集、免疫-炎癥應(yīng)答是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要原因[1,2]。巨噬細(xì)胞炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的各個(gè)階段都發(fā)揮重要作用,包括從動(dòng)脈粥樣硬化始發(fā)到斑塊破裂,從而引發(fā)血栓形成的級(jí)聯(lián)效應(yīng)[3]。因此尋找到一種巨噬細(xì)胞炎癥的調(diào)節(jié)因子可能成為動(dòng)脈粥樣硬化治療的新途徑。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是一種可對(duì)抗腺病毒E1A癌蛋白誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分泌型糖蛋白[4]。我們前期研究工作發(fā)現(xiàn),在兔和人動(dòng)脈粥樣硬化血管中CREG蛋白表達(dá)水平均較正常血管降低,并且在兔動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展過(guò)程中,CREG表達(dá)下調(diào)具有時(shí)間依賴性。這些結(jié)果提示CREG可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn),CREG具有抗炎的潛在作用[5]。從NCBI-UniGene網(wǎng)站的est數(shù)據(jù)庫(kù)檢索人和小鼠組織cregmrna資料,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)物種都是在淋巴結(jié)中creg表達(dá)量最高。淋巴結(jié)是富含巨噬細(xì)胞的組織,因此我們推斷creg可能對(duì)抗巨噬細(xì)胞炎癥,其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中具有重要作用。本研究擬明確creg是否參與并可抑制腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-alpha,tnf-α)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥并揭示其可能機(jī)制,并評(píng)估creg對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變是否有干預(yù)作用。材料和方法raw264.7小鼠巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染cregsirna以建立creg表達(dá)下調(diào)細(xì)胞模型。westernblot檢測(cè)creg,cathepsinb,cathepsinl,溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosome-associatedmembraneprotein1,lamp1),6-磷酸甘露糖/胰島素樣生長(zhǎng)因子ii受體(themannose6-phosphate/insulin-likegrowthfactoriireceptor,m6p/igfiir),lc3,beclin1,p62和tubulin表達(dá)水平。image-proplus軟件用于免疫印跡定量。小鼠il-6和mcp-1elisa試劑盒檢測(cè)il-6和mcp-1細(xì)胞上清分泌量和組織裂解產(chǎn)物中蛋白表達(dá)量。免疫熒光雙染色后共聚焦顯微鏡觀察his蛋白和cathepsinb/cathepsinl/m6p/igfiir/lamp1的共定位。lysotrackerred染色觀察溶酶體。電鏡觀察creg表達(dá)上調(diào)和下調(diào)細(xì)胞中自噬體和自噬溶酶體形成。免疫共沉淀檢測(cè)外源性重組creg蛋白和cathepsinb、cathepsinl、igfiir的相互作用。實(shí)驗(yàn)入選40只10周齡,體重20 25g的雄性apoe-/-小鼠,飼以含21%脂肪、1.3%膽固醇的高脂、高膽固醇飲食16周。在高脂喂養(yǎng)4-12周時(shí),對(duì)照組施以假手術(shù),實(shí)驗(yàn)組用微量滲透泵以30μg/kg/d皮下給予重組creg蛋白緩釋治療。收集小鼠主動(dòng)脈油紅o染色及蘇木素伊紅(hemotoxylin-esion,he)染色觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。免疫組織化學(xué)染色觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中cd68和mcp-1表達(dá)。結(jié)果1.creg表達(dá)與tnf-α誘導(dǎo)的raw264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)有相關(guān)關(guān)系tnf-α是一種具有促炎作用的多效性細(xì)胞因子。首先,為研究探討tnf-α刺激后,raw264.7細(xì)胞炎癥因子分泌情況,我們?cè)趓aw264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中加入20ng/mltnf-α分別刺激0,30min,2h,6h,12h,16h和24h,收集細(xì)胞上清,elisa檢測(cè)細(xì)胞上清il-6和mcp-1分泌量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),il-6和mcp-1分泌量對(duì)tnf-α刺激具有時(shí)間依賴性。同時(shí)在tnf-α刺激過(guò)程中,raw264.7細(xì)胞中creg表達(dá)先短暫升高,繼而呈時(shí)間依賴性降低。creg表達(dá)變化與tnf-α誘導(dǎo)的raw264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有相關(guān)性,提示creg可能在tnf-α誘導(dǎo)的炎癥中發(fā)揮重要作用。2.creg表達(dá)變化干預(yù)tnf-α誘導(dǎo)的raw264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)為探討creg對(duì)tnf-α誘導(dǎo)的raw264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用,我們應(yīng)用了gain-of-function和loss-of-function模型,通過(guò)檢測(cè)tnf-α刺激后細(xì)胞上清il-6及mcp-1分泌變化,觀察creg在raw264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。當(dāng)在tnf-α刺激的raw264.7細(xì)胞中添加不同濃度(0,0.5μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml)的外源性重組creg蛋白24h后,westernblot檢測(cè)外源重組creg蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)。westernblot檢測(cè)證實(shí)cregsirna轉(zhuǎn)染raw264.7細(xì)胞并用tnf-α刺激后,creg表達(dá)量較對(duì)照組降低82.7%(p0.001)。elisa結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組creg蛋白表達(dá)呈劑量依賴性抑制tnf-α刺激后raw264.7細(xì)胞中il-6和mcp-1分泌。相反,在轉(zhuǎn)染cregsirna下調(diào)creg表達(dá)變化后,raw264.7細(xì)胞中il-6和mcp-1分泌量較對(duì)照組增加。上述結(jié)果提示,creg表達(dá)上調(diào)可減輕炎癥反應(yīng),而creg表達(dá)下調(diào)則可以促進(jìn)炎癥因子分泌。因此,creg可對(duì)抗tnf-α誘導(dǎo)的raw264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。3.creg促進(jìn)raw264.7細(xì)胞自噬從而減輕tnf-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)已有研究報(bào)道證實(shí),自噬是細(xì)胞對(duì)抗炎癥損傷的重要防御機(jī)制之一[6,7]。因此,自噬也可能在巨噬細(xì)胞炎癥中發(fā)揮重要作用。為研究creg對(duì)自噬的影響,我們應(yīng)用gain-of-function和loss-of-function模型,用電鏡觀察creg表達(dá)上調(diào)和creg表達(dá)下調(diào)的raw264.7細(xì)胞中自噬體和自噬溶酶體發(fā)生情況,以獲得自噬激活的直接證據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)照組tnf-α刺激后raw264.7細(xì)胞中可見(jiàn)自噬泡和自噬體,添加外源性creg蛋白后細(xì)胞中自噬溶酶體數(shù)量明顯增加,而在轉(zhuǎn)染sirna下調(diào)creg表達(dá)的細(xì)胞中則僅見(jiàn)到少量自噬體。同時(shí),westernblot檢測(cè)證實(shí),外源性creg蛋白可誘導(dǎo)自噬,表現(xiàn)為自噬體結(jié)合蛋白lc3ii表達(dá)增加,beclin1增加,p62降低。p62是一種將泛素結(jié)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬體并在自噬過(guò)程中消耗的蛋白。在creg表達(dá)下調(diào)細(xì)胞中,lc3ii和beclin1表達(dá)量增加,自噬降解的底物蛋白p62也增加,提示自噬體堆積,自噬功能受損。為研究自噬在creg抗炎中的作用,我們應(yīng)用了自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-ma)和bafilomycina對(duì)抗細(xì)胞自噬激活,觀察tnf-α誘導(dǎo)的raw264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)情況。添加自噬抑制劑3-ma和bafilomycina后可對(duì)抗creg蛋白的炎癥抑制作用。這些結(jié)果提示自噬在tnf-α誘導(dǎo)的raw264.7細(xì)胞炎癥中發(fā)揮重要作用,creg可通過(guò)促進(jìn)自噬抑制tnf-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)。4.creg蛋白表達(dá)變化影響raw264.7細(xì)胞中溶酶體發(fā)生和cathepsinb、cathepsinl的成熟creg是一種定位于溶酶體的分泌型糖蛋白[8],為進(jìn)一步驗(yàn)證creg對(duì)溶酶體的作用,我們應(yīng)用gain-of-function和loss-of-function模型,觀察creg對(duì)cathepsinb、cathepsinl和lamp1表達(dá)的影響。免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),在添加外源性creg蛋白(20μg/ml)后,與對(duì)照組相比,raw264.7細(xì)胞中cathepsinb和cathepsinl熒光強(qiáng)度明顯增加;而在轉(zhuǎn)染cregsirna下調(diào)creg表達(dá)變化后,raw264.7細(xì)胞中cathepsinb和cathepsinl熒光強(qiáng)度明顯降低,表達(dá)量明顯減少。westernblot檢測(cè)creg表達(dá)變化對(duì)cathepsinb和cathepsinl的影響,其趨勢(shì)與免疫熒光染色結(jié)果相似。在添加外源性creg蛋白后,與對(duì)照組相比,raw264.7細(xì)胞中cathepsinb、cathepsinl和lamp1表達(dá)增加;而在轉(zhuǎn)染cregsirna下調(diào)creg表達(dá)變化后,raw264.7細(xì)胞中cathepsinb、cathepsinl和lamp1表達(dá)明顯降低。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),外源性添加creg蛋白后cathepsinb(25kda)和cathepsinl(25kda)的成熟體增多,成熟體與酶前體比例(25kda/40kda,25kda/42kda)增加(p0.05,p0.01);而在creg表達(dá)下調(diào)組,cathepsinb(25kda)和cathepsinl(25kda)的成熟體減少,成熟體與酶前體比例(25kda/40kda,25kda/42kda)降低(p0.05,p0.05)。以上結(jié)果提示,creg表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)raw264.7細(xì)胞中成熟形式的cathepsinb和cathepsinl表達(dá),并促進(jìn)lamp1表達(dá),而creg表達(dá)下調(diào)則抑制cathepsinb和cathepsinl成熟,并抑制lamp1表達(dá)。lysotrackerred是一種進(jìn)行了熒光標(biāo)記的帶有弱堿性的紅色熒光探針,可以選擇性地滯留在偏酸性的溶酶體中,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞溶酶體的特異性熒光標(biāo)記,可用來(lái)評(píng)估溶酶體數(shù)量[9]。在添加外源性creg蛋白后,與對(duì)照組相比,raw264.7細(xì)胞中l(wèi)ysotracker紅色熒光強(qiáng)度明顯增加;而在轉(zhuǎn)染cregsirna下調(diào)creg表達(dá)變化后,lysotracker紅色熒光強(qiáng)度明顯降低。上述結(jié)果提示,creg蛋白表達(dá)變化影響raw264.7細(xì)胞中溶酶體發(fā)生和cathepsinb、cathepsinl的成熟。由于溶酶體活性對(duì)自噬至關(guān)重要[10],我們推斷creg可能通過(guò)其對(duì)溶酶體的影響調(diào)節(jié)自噬過(guò)程。5.外源性creg重組蛋白定位于溶酶體并通過(guò)m6p/igfiir與溶酶體相互作用,且影響m6p/igfiir的細(xì)胞內(nèi)分布以往研究證實(shí),creg是一種與m6p/igfiir直接結(jié)合的溶酶體蛋白,并依賴于與m6p受體的相互作用有效轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體[8]。外源性添加creg蛋白是否與內(nèi)源性creg蛋白具有相同特性并能與m6p/igfiir相互作用尚不清楚。外源性creg蛋白是帶有his標(biāo)簽并通過(guò)與ni-nta柱結(jié)合純化的蛋白。為研究外源性creg蛋白與溶酶體的定位關(guān)系,分別以抗his抗體與抗cathepsinb、抗cathepsinl、抗lamp1、抗igfiir抗體,對(duì)添加了帶有his標(biāo)簽的外源性creg蛋白的raw264.7細(xì)胞行免疫熒光雙染,發(fā)現(xiàn)均有明確的共定位關(guān)系。免疫共沉淀提示帶有his標(biāo)簽的creg蛋白與溶酶體組織蛋白酶cathepsinb、cathepsinl和m6p/igfiir有直接相互作用關(guān)系。westernblot檢測(cè)creg表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)后,raw264.7細(xì)胞中m6p/igfiir表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),在添加外源性creg蛋白后,igfiir標(biāo)記的紅色熒光廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上,并與溶酶體結(jié)構(gòu)蛋白lamp1有共定位關(guān)系;而在creg表達(dá)下調(diào)的raw264.7細(xì)胞中,igfiir標(biāo)記的紅色熒光主要分布于細(xì)胞核周圍,且與lamp1僅有部分共定位關(guān)系。以上結(jié)果提示,外源性creg蛋白導(dǎo)入細(xì)胞后,與內(nèi)源性creg蛋白具有同樣的溶酶體定位。creg對(duì)m6p/igfiir表達(dá)變化無(wú)影響,而影響其在細(xì)胞內(nèi)的定位,m6p/igfiir對(duì)溶酶體的結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)有重要作用,因此,creg可能通過(guò)調(diào)節(jié)m6p/igfiir的細(xì)胞內(nèi)定位而影響溶酶體酶的表達(dá)變化和溶酶體發(fā)生,進(jìn)而影響了細(xì)胞自噬和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。6.creg重組蛋白干預(yù)可減輕高脂喂養(yǎng)的apoe-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化程度并影響主動(dòng)脈炎癥及自噬為研究creg蛋白對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變的影響,apoe-/-小鼠飼以含21%脂肪、1.3%膽固醇的高脂、高膽固醇飼料16周。高脂喂養(yǎng)的4-12周,對(duì)照組施行假性手術(shù),干預(yù)組于小鼠背部皮下埋置滲透性微量泵泵入CREG蛋白。主動(dòng)脈油紅O染色顯示,CREG蛋白埋泵干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈腔內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積較對(duì)照組明顯減小。HE染色可觀察到同樣結(jié)果。ELISA檢測(cè)CREG蛋白埋泵干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈組織勻漿中MCP-1表達(dá)量較對(duì)照組降低。免疫組織化學(xué)染色顯示CREG蛋白埋泵干預(yù)組主動(dòng)脈根部粥樣硬化斑塊中小鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68和MCP-1陽(yáng)性區(qū)域占斑塊面積百分比低于對(duì)照組。Western blot結(jié)果顯示,外源性CREG蛋白可誘導(dǎo)高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的自噬反應(yīng),表現(xiàn)為主動(dòng)脈組織蛋白中自噬體結(jié)合蛋白LC3 II表達(dá)增加,p62降低。以上結(jié)果證實(shí),外源性CREG蛋白干預(yù)可減輕高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變程度,抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)自噬,CREG可能通過(guò)上述機(jī)制發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用。結(jié)論CREG可以通過(guò)影響M6P/IGFIIR細(xì)胞內(nèi)分布而影響溶酶體發(fā)生,從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬,抑制炎癥。CREG可能在未來(lái)動(dòng)脈粥樣硬化治療中具有前景。
【關(guān)鍵詞】：E1A激活基因阻遏子 巨噬細(xì)胞 炎癥 自噬 溶酶體 動(dòng)脈粥樣硬化
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-13
• Abstract13-20
• 前言20-22
• 文獻(xiàn)回顧22-33
• 實(shí)驗(yàn)一 CREG對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的RAW 264.7 巨噬細(xì)胞炎癥的作用研究33-45
• 1 材料33-36
• 2 方法36-40
• 3 結(jié)果40-44
• 4 討論44-45
• 實(shí)驗(yàn)二 CREG影響溶酶體-自噬發(fā)生對(duì)抗TNF-α 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞炎癥45-66
• 1 材料45-48
• 2 方法48-51
• 3 結(jié)果51-62
• 4 討論62-66
• 實(shí)驗(yàn)三 CREG蛋白對(duì)高脂喂養(yǎng)ApoE?/? 小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變的作用研究66-79
• 1 材料66-68
• 2 方法68-72
• 3 結(jié)果72-76
• 4 討論76-79
• 小結(jié)79-80
• 參考文獻(xiàn)80-91
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果91-93
• 致謝93

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本文編號(hào)：374659