本文關(guān)鍵詞：RBP2蛋白和THOP1蛋白在非小細(xì)胞肺癌發(fā)展中的作用及相關(guān)機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及意義原發(fā)性肺癌是全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,幾十年來其發(fā)病率在世界各地均呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢,是目前全世界惡性腫瘤致死的最主要原因。肺癌具有發(fā)病隱匿和進(jìn)展迅速的特點(diǎn),一般臨床發(fā)現(xiàn)較晚,在惡性腫瘤導(dǎo)致的死亡中,肺癌居首位。盡管在肺癌的根治性手術(shù),放療、化療等綜合性治療中取得了較大進(jìn)展,但患者的生活質(zhì)量和生存時間均無法令人滿意。隨著對腫瘤分子機(jī)制研究的不斷深入,人們逐漸意識到惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素,多步驟,多基因共同參與的復(fù)雜的演變過程。腫瘤的生物治療和基因治療成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)和新希望。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程高度依賴于豐富的新生血管提供營養(yǎng),腫瘤血管生成是指腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的微血管生長及腫瘤微環(huán)境中血液循環(huán)的建立,在惡性腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮了極其重要的作用,并由此提出了抑制腫瘤生長的新途徑—抗腫瘤血管生成治療。腫瘤血管生成是一個極其復(fù)雜和協(xié)調(diào)的過程,受多因子不同層次的調(diào)控�？寡苌芍委�,以腫瘤的新生血管為作用靶點(diǎn),通過切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移路徑,阻止腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移,是一種重要的靶向治療方法。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和缺氧誘導(dǎo)因子la (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)在腫瘤血管生成過程中的作用至關(guān)重要。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)將新生血管內(nèi)皮細(xì)胞染色,并通過染色計算微血管密度(microvessel density, MVD)為公認(rèn)的評估腫瘤血管生成的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究以CD34蛋白標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞,計數(shù)MVD。Retinoblastoma binding protein 2 (RBP2)作為JARID蛋白家族的新成員,其組蛋白去甲基化酶的活性能夠使發(fā)生三或二甲基化的組蛋白H3的第四個賴氨酸位點(diǎn)(H3-K4)去甲基化。RBP2可以通過抑制多種靶基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的分化。然而,RBP2與pRB結(jié)合后,就由轉(zhuǎn)錄抑制子變成了轉(zhuǎn)錄激活子。最近的研究表明,RBP2蛋白通過與整合素β1 (ITGBβ1)的啟動子結(jié)合進(jìn)而調(diào)控肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為,另有研究發(fā)現(xiàn)RBP2蛋白通過激活A(yù)kt信號通路上調(diào)N-cadherin和Snail的表達(dá)水平進(jìn)而促進(jìn)肺癌的侵襲和遷移,而ITGBβ1和Akt信號通路可以調(diào)控VEGF等下游分子的表達(dá)參與腫瘤血管生成。因此,RBP2蛋白可能在惡性腫瘤血管生成過程中扮演重要角色。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤導(dǎo)致患者死亡的主要原因,也是惡性腫瘤治療領(lǐng)域中一直尚未解決的難題,惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移涉及腫瘤細(xì)胞之間黏附力的降低、腫瘤細(xì)胞與基底膜的緊密附著、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、腫瘤細(xì)胞侵入血管或淋巴管、黏附于內(nèi)皮細(xì)胞而停留在遠(yuǎn)隔部位、向外侵襲并誘導(dǎo)血管生成、逃避宿主抗腫瘤反應(yīng)并在轉(zhuǎn)移部位繼續(xù)生長。從理論上講,阻斷上述多階段連續(xù)過程中的任何一個環(huán)節(jié)就有可能阻斷惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此,研究惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及其相應(yīng)的治療策略具有極其重要的意義�；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是鋅離子依賴性的蛋白水解酶,能夠降解破壞腫瘤原發(fā)位點(diǎn)的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜,使惡性腫瘤細(xì)胞從缺口處發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。Thimet oligopeptidase (THOP1)是一個由77個氨基酸組成的具有HEXXH鋅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的金屬內(nèi)肽酶,參與多種肽類激素和神經(jīng)肽(長度為5-17個氨基酸的短肽)的代謝,包括緩激肽、促性腺激素釋放激素、阿片肽和神經(jīng)降壓素等。較早的研究發(fā)現(xiàn)THOP1在大腦、垂體和性腺等富含神經(jīng)肽的組織中高表達(dá),隨著研究的進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)THOP1在人類多種腫瘤組織和正常組織的細(xì)胞漿、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和細(xì)胞核中均有表達(dá)。最近的研究發(fā)現(xiàn)肝癌周圍正常組織中THOP1 mRNA高表達(dá)的患者生存率顯著高于mRNA低表達(dá)的患者。另外,黑素瘤細(xì)胞中THOP1可以抑制由緩激肽誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成。這些結(jié)果表明THOP1可能是一個潛在的抗腫瘤治療劑。第一部分RBP2蛋白與非小細(xì)胞肺癌血管生成及預(yù)后的相關(guān)性研究目的檢測Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)組織中RBP2蛋白、HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和CD34蛋白的表達(dá)情況,結(jié)合患者的臨床病理資料和術(shù)后隨訪資料進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計分析,研究RBP2蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征、腫瘤血管生成及預(yù)后的相關(guān)性。探討RBP2蛋白表達(dá)對NSCLC細(xì)胞體外促血管形成能力的影響及其相關(guān)分子機(jī)制。方法收集在2006年1月至2008年12月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院胸外科行肺癌切除加系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃的102例Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者的組織標(biāo)本,采用免疫組化方法檢測RBP2蛋白、HIF-1α蛋白和VEGF蛋白的表達(dá),抗CD34抗體標(biāo)記腫瘤組織內(nèi)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞,并計數(shù)MVD。應(yīng)用SPSS 17.0軟件建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行統(tǒng)計分析。卡方檢驗(yàn)分析RBP2蛋白、MVD與患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系,Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線,Log-rank檢驗(yàn)比較患者的生存差別,Cox回歸多因素分析判定獨(dú)立的預(yù)后因素。采用western blot檢測BEAS2B、SK-MES-1、A549、 SPCA-1和H1975中RBP2蛋白的表達(dá)水平,以脂質(zhì)體2000作為轉(zhuǎn)染試劑,將特異性沉默RBP2基因的siRNA轉(zhuǎn)染入RBP2基因表達(dá)水平最高的H1975細(xì)胞株內(nèi),將特異性過表達(dá)RBP2基因的pcDNA3-HA-RBP2轉(zhuǎn)染入RBP2基因表達(dá)水平最低的SK-MES-1細(xì)胞株內(nèi)。體外內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞促血管形成能力的變化。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測各不同處理組細(xì)胞的上清液中VEGF的表達(dá)水平。Real-time PCR檢測處理的細(xì)胞中HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)水平的變化,western blot檢測處理的細(xì)胞中RBP2蛋白、HIF-la蛋白、VEGF蛋白、Akt蛋白(?)p-Akt蛋白表達(dá)情況的變化。結(jié)果1.在102例Ⅰ期NSCLC標(biāo)本中,有52例RBP2蛋白呈高表達(dá),占總病例數(shù)的51%。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)比較RBP2蛋白表達(dá)與患者不同臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性,結(jié)果顯示：RBP2蛋白高表達(dá)與腫瘤的T分期(P=0.030)、HIF-1α蛋白高表達(dá)(P=0.028)及VEGF蛋白高表達(dá)(P=0.048)密切相關(guān),而與患者的年齡、性別、吸煙史、腫瘤組織類型及分化程度均無顯著的相關(guān)性(P0.05)。2.102例Ⅰ期NSCLC標(biāo)本中MVD計數(shù)范圍為6.4～102,其中高M(jìn)VD者46例,占總病例數(shù)的45.1%。卡方檢驗(yàn)比較MVD與患者不同臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性,結(jié)果顯示：高M(jìn)VD與HIF-1α蛋白高表達(dá)(P=0.034)及VEGF蛋白高表達(dá)(P=0.001)密切相關(guān)。3. Mann-Whitney U test分析結(jié)果顯示：NSCLC組織中RBP2蛋白高表達(dá)與高M(jìn)VD計數(shù)密切相關(guān)(P=0.033)。4. Kaplan-Meier分析的結(jié)果顯示：RBP2蛋白高表達(dá)患者的5年生存率顯著低于RBP2蛋白低表達(dá)的患者(53.8% vs 72.0%,P=0.037)；高M(jìn)VD患者的5年生存率顯著低于低MVD的患者(52.2% vs 71.4%, P=0.040)。Cox多因素分析的結(jié)果表明RBP2蛋白高表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P=0.044)。5. Western blot檢測RBP2蛋白在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株SK-MES-1, A549,SPCA-1和H1975高于支氣管上皮細(xì)胞BEAS2B,其中,RBP2蛋白在H1975細(xì)胞表達(dá)最高,在SK-MES-1細(xì)胞表達(dá)最低。RBP2-siRNAl和RBP2-siRNA2均能顯著抑制H1975細(xì)胞中RBP2蛋白的表達(dá)；pcDNA3-HA-RBP2能顯著增加SK-MES-1細(xì)胞中RBP2蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果表明RBP2-siRNA1、RBP2-siRNA2和pcDNA3-HA-RBP2均可用于后續(xù)的RBP2蛋白體外功能的實(shí)驗(yàn)研究。6.由RBP2沉默的H1975細(xì)胞(siRNA1:12.33+3.06,siRNA2:9.67+1.53)產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基促HUVECs形成管狀結(jié)構(gòu)的能力顯著低于對照組(38.67+2.52,P0.01)。7. ELISA結(jié)果顯示RBP2沉默(siRNA1:0.99±0.11 ng/ml, siRNA2:0.94±0.14 ng/ml)的H1975細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基中VEGF的水平顯著低于對照組(1.87±0.10 ng/ml,P0.01)。另外,在加入VEGFR：抑制劑舒尼替尼蘋果酸鹽(2.5μM)后,陰性對照組產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基促HUVECs形成管狀結(jié)構(gòu)的能力顯著降低(10.33+2.22,P0.01)；在加入VEGF-165 (2 ng/ml)后,干擾組產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基促HUVECs形成管狀結(jié)構(gòu)的能力顯著提高(41.03+3.25,P0.01)。8.常氧條件下RBP2蛋白激活HIF-1α蛋白的表達(dá)具有時間依賴性,峰值出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后36小時。在H1975細(xì)胞中沉默RBP2蛋白的表達(dá)引起HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表達(dá)降低,在SK-MES-1細(xì)胞中過表達(dá)RBP2蛋白引起HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表達(dá)升高。9.RBP2蛋白通過激活HIF-1α蛋白的表達(dá)促進(jìn)了VEGF的表達(dá)。10.RBP2蛋白通過PI3K/Akt信號通路激活HIF-1α蛋白的表達(dá)。VEGF可以激活由RBP2調(diào)控的p-Akt的表達(dá),提示Akt和VEGF之間可能存在一個回饋循環(huán)。結(jié)論本研究結(jié)果表明RBP2高表達(dá)與高M(jìn)VD在Ⅰ期NSCLC組織中普遍存在,RBP2高表達(dá)與NSCLC腫瘤大小、HIF-1α高表達(dá)、VEGF高表達(dá)和高M(jìn)VD密切相關(guān)。RBP2蛋白高表達(dá)與患者術(shù)后生存期密切相關(guān),為影響Ⅰ期NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立因素。在常氧條件下,RBP2蛋白通過PI3K/Akt信號通路增強(qiáng)HIF-1α和VEGF的表達(dá),在NSCLC的血管生成過程中可能發(fā)揮重要作用,此外,VEGF可以激活由RBP2調(diào)控的p-Akt的表達(dá),提示Akt和VEGF之間可能存在一個回饋循環(huán)。本研究的結(jié)果顯示RBP2蛋白可能成為抗非小細(xì)胞肺癌血管生成治療的新靶第二部分THOP1蛋白與非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相關(guān)性研究目的檢測THopi蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)水平,探討THOP1蛋白表達(dá)與患者各臨床病理指標(biāo)、術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)及預(yù)后的相關(guān)性。采用RNA干擾技術(shù)特異性抑制NSCLC細(xì)胞內(nèi)THOP1蛋白的表達(dá),探討THOP1蛋白表達(dá)與NSCLC細(xì)胞體外侵襲及遷移能力的相關(guān)性。方法收集2006年1月到2007年12月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院胸外科行肺葉切除加系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃的NSCLC患者的組織標(biāo)本,其中,NSCLC組織標(biāo)本120例,正常肺組織53例(距腫瘤邊緣5厘米以上)。應(yīng)用免疫組化方法檢測THOP1蛋白的表達(dá)。應(yīng)用SPSS 17.0軟件建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行統(tǒng)計分析�？ǚ綑z驗(yàn)分析THOP1蛋白與患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系,Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線,Log-rank檢驗(yàn)比較患者的生存差別,Cox回歸多因素分析判定獨(dú)立的預(yù)后因素。采用Real-time PCR和western blot檢測肺癌組織、正常肺組織和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中THOP1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。將siRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞株內(nèi)特異性沉默THOP1基因。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的變化；’Trans well侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力的變化；明膠酶譜檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9活性的變化。結(jié)果1.在120例NSCLC組織標(biāo)本中有49例表現(xiàn)為THOP1蛋白高表達(dá),高表達(dá)率為40.8%,在53例正常肺組織標(biāo)本中有31例表現(xiàn)為THOP1蛋白高表達(dá),高表達(dá)率為58.5%。THOP1蛋白在正常肺組織中的高表達(dá)率顯著高于NSCLC組織(卡方檢驗(yàn),P=0.032)。 NSCLC組織標(biāo)本中THOP1蛋白低表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.048),而與患者其他臨床病理指標(biāo)無顯著相關(guān)性(P0.05)。采用Real-timePCR和western blot檢測16名患者的NSCLC組織標(biāo)本及其相應(yīng)正常肺組織,結(jié)果顯示,NSCLC標(biāo)本中THOP1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著低于正常肺組織。2.單因素生存分析結(jié)果顯示,THOP1蛋白低表達(dá)的患者,其術(shù)后5年的無病生存率(P=0.038)和總生存率(P=0.017)均分別顯著低于THOP1蛋白高表達(dá)的患者。另外,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(29.0% vs 50.0%,P=0.025)以及TNM分期較晚的患者(30.1% vs 53.2%,P=0.009)其術(shù)后5年的總生存率均顯著降低。Cox回歸多因素分析的結(jié)果顯示,THOP1蛋白低表達(dá)分別是判定患者無病生存率(P=0.046)和總生存率(P=0.021)的獨(dú)立預(yù)后因素。3. THOP1蛋白在A549、H1299、SPCA-1和H322M等4種NSCLC細(xì)胞株中存在不同程度的表達(dá),H1299細(xì)胞THOP1的表達(dá)水平最高。選取H1299細(xì)胞進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)。THOP1-siRNA1和THOP1-siRNA2均能顯著抑制H1299細(xì)胞中THOP1蛋白的表達(dá),陰性對照組的Control siRNA對RBP2蛋白的表達(dá)無明顯影響。4.抑制H1299細(xì)胞內(nèi)THOP1蛋白的表達(dá),劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞的遷移能力顯著增高(P0.01)。5.抑制 H1299細(xì)胞內(nèi)THOP1蛋白的表達(dá),Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞的侵襲能力顯著增高(P0.01)。6.抑制 H1299細(xì)胞內(nèi)THOP1蛋白的表達(dá),明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9的活性顯著增高(P0.01)。結(jié)論THOP1蛋白在正常肺組織的表達(dá)水平顯著高于NSCLC組織,THOP1蛋白低表達(dá)與肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)及不良預(yù)后密切相關(guān)；檢測THOP1蛋白蛋白的表達(dá)水平可作為判定患者不良預(yù)后的參考指標(biāo)。采用RNA干擾技術(shù)抑制THOPl蛋白的表達(dá),H1299細(xì)胞的遷移、侵襲能力顯著增強(qiáng),明膠酶譜結(jié)果顯示THOP1蛋白可能是通過調(diào)控MMP-9的活性影響H1299細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程。THOP1蛋白可能成為抗非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移治療的新抗腫瘤劑。
【關(guān)鍵詞】：RBP2蛋白 非小細(xì)胞肺癌 HIF-1α VEGF Akt 血管生成 THOP1蛋白 非小細(xì)胞肺癌 復(fù)發(fā) 預(yù)后 侵襲轉(zhuǎn)移 MMP-9
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-20
• 符號說明20-22
• 第一部分 RBP2蛋白與非小細(xì)胞肺癌血管生成及預(yù)后的相關(guān)性研究22-59
• 前言22-24
• 材料方法24-36
• 結(jié)果36-39
• 討論39-42
• 結(jié)論42-43
• 附圖表43-52
• 參考文獻(xiàn)52-59
• 第二部分 THOP1與非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相關(guān)性研究59-82
• 前言59-60
• 材料方法60-65
• 結(jié)果65-67
• 討論67-69
• 結(jié)論69-70
• 附圖表70-78
• 參考文獻(xiàn)78-82
• 致謝82-83
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文83-84
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表84-85
• 英文文章Ⅰ85-116
• 英文文章Ⅱ116-134

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 熊松柏;楊康;;基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究進(jìn)展[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2006年11期

  本文關(guān)鍵詞：RBP2蛋白和THOP1蛋白在非小細(xì)胞肺癌發(fā)展中的作用及相關(guān)機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：374658