炎癥性腸�。↖nflammatory bowel disease,IBD）是一組不明原因的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis,UC）和克羅恩�。–rohn’s disease,CD）。目前IBD的發(fā)病原因和病理生理機(jī)制仍未完全明確,其發(fā)生可能與腸黏膜組織內(nèi)固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答異常、腸道微生物、腸黏膜屏障損傷、遺傳易感性以及環(huán)境因素等有關(guān)。對(duì)IBD患者進(jìn)行大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)研究,發(fā)現(xiàn)了近200個(gè)IBD易感基因,除少量位于基因編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性（Single-Nucleotide Polymorphisms,SNP）位點(diǎn)可直接影響氨基酸序列外,大部分SNP位點(diǎn)的功能和對(duì)疾病表型的分子貢獻(xiàn)仍不明確。此外,病原微生物感染作為環(huán)境觸發(fā)因素,作用于攜帶易感基因的個(gè)體被認(rèn)為是IBD的主要發(fā)病機(jī)制。因此,針對(duì)IBD易感基因位點(diǎn)的功能,以及易感基因與環(huán)境觸發(fā)因素相互作用進(jìn)行研究對(duì)解析IBD的發(fā)病機(jī)制和疾病的診療都具有重要意義。Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase/signal transducer and activat... 

【文章頁數(shù)】：171 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮略詞
第一部分 STAT5A SNP rs7220367在IBD中的致病機(jī)制研究
    前言
    材料和方法
        1. 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
            1.2 主要試劑與儀器
            1.3 主要溶液的配制
        2. 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及凍存
            2.2 CRISPR/Cas9質(zhì)粒構(gòu)建
            2.3 細(xì)菌轉(zhuǎn)化
            2.4 質(zhì)粒小提
            2.5 無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取
            2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
            2.7 微量基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增
            2.8 T7E1酶切驗(yàn)證Cas9切割效率
            2.9 克隆挑選
            2.10 突變細(xì)胞系篩選和脫靶位點(diǎn)檢測(cè)
            2.11 總RNA提取
            2.12 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
            2.13 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
            2.14 劃痕實(shí)驗(yàn)
            2.15 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)
            2.16 EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖
            2.17 CFSE染色檢測(cè)細(xì)胞增殖
            2.18 生長(zhǎng)曲線
            2.19 凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
            2.20 胞漿蛋白和胞核蛋白提取
            2.21 蛋白濃度測(cè)定
            2.22 蛋白電泳和免疫印跡
            2.23 免疫熒光檢測(cè)
        3 統(tǒng)計(jì)分析
    結(jié)果
        1. 應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立SNP rs7220367突變細(xì)胞系
            1.1 SNPrs7220367基因定位
            1.2 sgRNA和ssODN設(shè)計(jì)與合成
            1.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒PX458-sgRNA測(cè)序鑒定結(jié)果
            1.4 sgRNA-PX458轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞驗(yàn)證切割效率
            1.5 PX458-sgRNA和ssODN共轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞驗(yàn)證耙基因編輯效率和脫靶率
        2. 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果
            2.1 總RNA提取及質(zhì)量檢測(cè)
            2.2 mRNAs測(cè)序原始數(shù)據(jù)基本情況
            2.3 基因組比對(duì)
            2.4 mRNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)
            2.5 差異表達(dá)分析
            2.6 聚類分析
            2.7 功能分析
            2.8 差異表達(dá)mRNA的KEGG通路分析
            2.9 IBD相關(guān)差異表達(dá)mRNA的KEGG通路分析
            2.10 RT-qPCR驗(yàn)證部分差異表達(dá)的mRNAs
        3. SNPrs7220367對(duì)HCT116細(xì)胞遷移能力的影響
            3.1 SNP rs7220367促進(jìn)HCT116細(xì)胞遷移
            3.2 SNP rs7220367抑制細(xì)胞刺激因子促進(jìn)細(xì)胞遷移能力
            3.3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4. HCT116細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            4.1 EdU染色檢測(cè)細(xì)胞短期增殖
            4.2 CFSE染色細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Annexin Ⅴ凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            4.3 HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
        5. Western Blot檢測(cè)結(jié)果
        6. 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果
        7. SNP rs7220367對(duì)胚胎干細(xì)胞系H9的影響
    討論
    小結(jié)
第二部分 腸道上皮干細(xì)胞Stat5敲除對(duì)小鼠感染鼠傷寒沙門氏菌的影響研究
    前言
    材料和方法
        1. 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株
            1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
            1.4 主要試劑配制
        2. 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因型鑒定
            2.2 鼠傷寒沙門氏菌感染實(shí)驗(yàn)
            2.3 腸道通透性檢測(cè)
            2.4 細(xì)菌異位檢測(cè)
            2.5 HE染色
            2.6 免疫組織化學(xué)染色
            2.7 免疫熒光染色
            2.8 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞因子
            2.9 糞便16S測(cè)序
            2.10 糞便DNA提取
            2.11 RT-qPCR驗(yàn)證16S測(cè)序結(jié)果
        3. 統(tǒng)計(jì)分析
    結(jié)果
        1. Lgr5CreER;:Stat5~(f/f)雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定
        2. 鼠傷寒沙門氏菌感染實(shí)驗(yàn)小鼠基本信息
        3. FD4腸道通透性檢測(cè)結(jié)果
        4. 細(xì)菌移位檢測(cè)結(jié)果
        5. 腸道炎癥病理評(píng)分
        6. 免疫組化和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果
        7. 炎癥因子檢測(cè)結(jié)果
        8. 糞便樣本16S測(cè)序結(jié)果
        9. qPCR驗(yàn)證結(jié)果
    討論
    小結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷
致謝



本文編號(hào)：3714950