目的:觀察p38 MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞衰老在結(jié)膜松弛癥（conjunctivochalasis,CCH）發(fā)病中的作用,研究杞精明目湯對(duì)p38介導(dǎo)的CCH細(xì)胞衰老的保護(hù)作用,為CCH發(fā)病機(jī)制的探索及治療提供一種新的思路。方法:1.培養(yǎng)CCH結(jié)膜成纖維細(xì)胞,通過(guò)RNA干擾技術(shù)構(gòu)建p38干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染原代分離的CCH成纖維細(xì)胞,并用q-PCR和Western blot檢測(cè)p38α的表達(dá),篩選有效的干擾片段。2.培養(yǎng)CCH和正常人的結(jié)膜成纖維細(xì)胞,分別用RNA干擾技術(shù)和p38抑制劑SB203580處理,分為五組（Control、CCH、CCH+si NC、CCH+siP38、CCH+SB203580）。采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖,β-gal染色檢測(cè)細(xì)胞衰老,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species,ROS）,分光光度計(jì)比色法檢測(cè)超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活力,q-PCR及Western blot檢測(cè)p38α、p53、p21、SMP30的表達(dá)。3.培養(yǎng)CCH和正常人的結(jié)膜成纖維細(xì)胞,分別用杞精明目湯顆粒劑和p38... 

【文章頁(yè)數(shù)】：155 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略詞
引言
第一部分 RNA干擾技術(shù)構(gòu)建p38α干擾慢病毒載體
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 溶液配制
            1.1.3 主要儀器及耗材
            1.1.4 載體及細(xì)胞
        1.2 方法
            1.2.1 標(biāo)本的采集與保存
            1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代
            1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組
            1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)
            1.2.5 重組干擾慢病毒包裝
            1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)(Quantitiative Real-time PCR,q-PCR)
            1.2.7 Western blot檢測(cè)
        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2 結(jié)果
        2.1 RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.1.1 干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)果
            2.1.2 測(cè)序
        2.2 RNA干擾有效靶點(diǎn)的篩選
            2.2.1 RNA干擾后CCH成纖維細(xì)胞p38α基因的表達(dá)
            2.2.2 RNA干擾后CCH成纖維細(xì)胞中p38α蛋白的表達(dá)
    3 討論
    4 小結(jié)
第二部分 p38介導(dǎo)結(jié)膜松弛癥細(xì)胞衰老的研究
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 溶液配制
            1.1.3 主要儀器及耗材
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 標(biāo)本的采集與保存
            1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代
            1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組
            1.2.4 細(xì)胞活性試劑盒(Cell counting kit-8, CCK-8)檢測(cè)
            1.2.5 β-半乳糖苷酶((β-galactosidase,β-gal)染色
            1.2.6 活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測(cè)
            1.2.7 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力測(cè)定
            1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
            1.2.9 Western blot檢測(cè)
        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2 結(jié)果
        2.1 結(jié)膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)情況
        2.2 結(jié)膜松弛癥中細(xì)胞衰老的情況
        2.3 p38對(duì)結(jié)膜成纖維細(xì)胞增殖的影響
        2.4 p38對(duì)結(jié)膜成纖維細(xì)胞ROS的影響
        2.5 p38對(duì)結(jié)膜成纖維細(xì)胞SOD的影響
        2.6 p38對(duì)結(jié)膜成纖維細(xì)胞衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響
        2.7 p38對(duì)結(jié)膜成纖維細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
    3 討論
    4 小結(jié)
第三部分 杞精明目湯對(duì)p38介導(dǎo)的結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞衰老的影響
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 溶液配制
            1.1.3 主要儀器及耗材
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 標(biāo)本的采集與保存
            1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代
            1.2.3 杞精明目湯顆粒劑的制備
            1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組
            1.2.5 CCK-8檢測(cè)
            1.2.6 活性氧(Reactive oxygen species, ROS)含量檢測(cè)
            1.2.7 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活力測(cè)定
            1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
            1.2.9 Western blot檢測(cè)
            1.2.10 質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.11 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2 結(jié)果
        2.1 杞精明目湯干預(yù)后結(jié)膜成纖維細(xì)胞的增殖情況
        2.2 杞精明目湯對(duì)結(jié)膜成纖維細(xì)胞ROS的影響
        2.3 杞精明目湯對(duì)結(jié)膜成纖維細(xì)胞SOD的影響
        2.4 杞精明目湯對(duì)結(jié)膜成纖維細(xì)胞衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響
        2.5 杞精明目湯對(duì)結(jié)膜成纖維細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
        2.6 杞精明目湯對(duì)p38啟動(dòng)子活性的影響
    3 討論
    4 小結(jié)
第四部分 杞精明目湯對(duì)結(jié)膜松弛癥細(xì)胞衰老的臨床研究
    1 資料與方法
        1.1 研究對(duì)象
        1.2 結(jié)膜松弛癥診斷與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
            1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)
            1.2.2 臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
        1.3 病例入選相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)
            1.3.1 納入標(biāo)準(zhǔn)
            1.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn)
            1.3.3 剔除標(biāo)準(zhǔn)
            1.3.4 病例脫落及處理
        1.4 材料與儀器
            1.4.1 中藥方劑和西藥
            1.4.2 主要試驗(yàn)材料與儀器
        1.5 治療方法
        1.6 分組及隨機(jī)方法
            1.6.1 樣本量的估算及其計(jì)算的依據(jù)
            1.6.2 隨機(jī)分組方法
            1.6.3 盲法和對(duì)照
        1.7 觀察指標(biāo)
            1.7.1 裂隙燈顯微鏡檢查
            1.7.2 國(guó)際眼表疾病指數(shù)量表(OSDI)
            1.7.3 淚膜破裂時(shí)間(BUT)
            1.7.4 基礎(chǔ)淚液分泌試驗(yàn)(SIT)
        1.8 手術(shù)方法
        1.9 標(biāo)本處理及細(xì)胞衰老染色
            1.9.1 取材與固定
            1.9.2 切片
            1.9.3 冰凍切片細(xì)胞衰老染色
        1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    2 結(jié)果
        2.1 兩組CCH患者治療前后OSDI評(píng)分
        2.2 兩組CCH患者治療前后BUT
        2.3 兩組CCH患者治療前后SIT
        2.4 兩組CCH患者細(xì)胞衰老染色
    3 討論
    4 小結(jié)
創(chuàng)新點(diǎn)
結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄一 :文獻(xiàn)綜述 衰老在祖國(guó)醫(yī)學(xué)的認(rèn)識(shí)及其中藥研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
附錄二 :在校期間科研成果
附錄三 :參加科研和學(xué)術(shù)活動(dòng)
附件


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]《本草綱目》對(duì)衰老的認(rèn)識(shí)及其防治老年病的思想特點(diǎn)[J]. 薄文集,石和元,王平.  湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(02)
[3]杞精明目湯含藥血清對(duì)結(jié)膜松弛癥MAPK信號(hào)通路的影響[J]. 賈元玲,項(xiàng)敏泓,黃麗,李青松,文杭,詹月萍.  中國(guó)中醫(yī)眼科雜志. 2018(02)
[4]杞精明目湯顆粒劑對(duì)腫瘤壞死因子-α刺激下結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響[J]. 賈元玲,項(xiàng)敏泓,文杭,李青松,詹月萍,黃麗,劉曉靜.  眼科新進(jìn)展. 2018(04)
[5]黑果枸杞原花青素對(duì)小鼠衰老皮膚抗氧化作用及凋亡相關(guān)蛋白的影響[J]. 羅文娟,冶娟,馬文宇,郭硯,陶叢敏.  山東醫(yī)藥. 2018(10)
[6]靈芝的抗衰老與抗阿爾茨海默病的藥理研究進(jìn)展[J]. 林志彬.  神經(jīng)藥理學(xué)報(bào). 2018(01)
[7]基于microRNA-34a/SIRT1/p53通路探討三七皂苷R1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響[J]. 賴小華,雷燕,楊靜,修成奎.  中國(guó)中藥雜志. 2018(03)
[8]黃精多糖抗衰老作用及其食品應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 衡銀雪,劉丹丹,邊鳳霞,殷鐘意,鄭旭煦.  重慶工商大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2017(06)
[9]人參皂苷Rg1基于SIRT6/NF-κB信號(hào)通路對(duì)輻射致造血干/祖細(xì)胞衰老的保護(hù)作用[J]. 李淵,周玥,王亞平,何穎紅,丁繼超,韓艷軍,王翠麗.  中草藥. 2017(21)
[10]麥冬文獻(xiàn)考證[J]. 石開玉.  遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào). 2017(10)



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