本文關鍵詞：唐氏綜合征產(chǎn)前篩查母體血液生物新標志物篩選及檢測方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：唐氏綜合征(Down's syndrome,DS)是由21號染色體異常而引起的一種常見體智發(fā)育缺陷性遺傳病,患者多表現(xiàn)為肢體和器官發(fā)育畸形,并常伴有明顯的智力缺陷。目前DS在人群中的發(fā)病率約為0.1~0.2%,且隨著工作壓力和婦女妊娠年齡的增加,及輔助生育技術的廣泛應用,其發(fā)病率還有進一步升高的趨勢。目前,DS作為一種先天遺傳性疾病,尚缺乏可靠治愈方法,DS患兒的出生將會給患者及其家庭、社會帶來較大的痛苦和負擔。因此,為了盡早準確診斷DS妊娠,減少患兒出生,多種產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷技術被廣泛應用于DS妊娠早中期的產(chǎn)前診斷。通過羊膜穿刺和絨膜取樣等技術取材,對胎兒脫落細胞的染色體檢查可準確鑒別DS患兒,是當前DS產(chǎn)前診斷的金標準,但有創(chuàng)穿刺技術可導致1%左右的流產(chǎn)風險,不宜在孕婦中廣泛推廣。臨床最常用的手段是先在妊娠早中期利用母體血清標志物進行產(chǎn)前篩查,DS妊娠高風險孕婦再進行染色體檢查。常用的DS產(chǎn)前篩查方法是將孕婦年齡、母體血清標志物、胎兒超聲標志物等檢測指標整合成多種篩查方案,進而在孕早期或中期進行DS妊娠高危風險的篩查評估。目前,臨床最常用的篩查組合是血清生化標志物聯(lián)合篩查方案以及血清生化標志物篩查結(jié)合超聲檢查指標方案。本研究首先采用Meta分析方法,對甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、非結(jié)合雌三醇(unconjugated estriol,uE3)和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)組成的母體血清三聯(lián)篩查(serum triple screening test,STS)模式和血清生化篩查指標與胎兒頸項部半透明層厚度(ultrasonographic nuchal translucency,NT)超聲檢測指標組成的整合式篩查(integrated screening test,INS)模式進行了系統(tǒng)的評估與比較。而后在前期DS妊娠母體血清比較蛋白組學研究和DS產(chǎn)前篩查常用血清生化標志物方法進行Meta分析基礎上,從系統(tǒng)生物學角度出發(fā),對DS孕婦血液進行整體代謝組學和microRNA組學研究,并基于Western blot技術對前期獲得的多種唐氏妊娠相關母體血清蛋白質(zhì)新標志物進行驗證,建立了三種蛋白標志物的時間分辨熒光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)方法,本研究結(jié)果有望為唐氏綜合征的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查提供母體血液潛在新標志物和篩查檢測新方法。目的1.評估sts和ins兩種組合篩查方案在ds妊娠產(chǎn)前篩查中的檢測性能;2.建立ds妊娠母體血清代謝組學診斷模型,篩選ds妊娠相關的潛在母體血清代謝標志物,探討ds疾病發(fā)生發(fā)展可能涉及的生化代謝通路;3.篩選ds妊娠相關的潛在母體血漿microrna標志物,探討與疾病發(fā)生可能相關的基因表達調(diào)控情況;4.對前期篩選獲得的ds妊娠相關的母體血清dgtpase、β2-糖蛋白i(beta2-glycoproteini,β2-gpi)、補體因子h相關蛋白1前體(complementfactorh-relatedprotein1precursor,cfhr1)和激肽原1亞基2(kininogen1isoform2,kng1)等4種蛋白標志物進行驗證,并建立相應的trfia檢測方法。方法1.利用pubmed,isisciencecitationindex和embase三大外文數(shù)據(jù)庫,以及中國生物醫(yī)學文獻服務系統(tǒng)、中國知識基礎設施工程、維普期刊資源整合服務平臺等三大中文數(shù)據(jù)庫,系統(tǒng)搜索與sts和ins兩種常用唐氏產(chǎn)前篩查方案相關的各種文獻資料,參考cochranelibrary協(xié)作網(wǎng)的診斷性實驗研究中關于meta分析的文獻篩選標準,確定本研究的納入和排除標準,篩選出所有符合要求的出版文獻。采用診斷性研究的文獻質(zhì)量評分(quadas-2)標準對納入文獻進行質(zhì)量評價,提取各篇文獻的作者姓名、出版時間、國家或地區(qū)、樣本的來源和種類、樣本例數(shù)、唐氏篩查組合模式、風險閾值,quadas-2評分等相關數(shù)據(jù)資料。整合數(shù)據(jù)采用meta-disc(1.4版本)和revman(5.2版本)軟件進行分析,通過summaryreceiveroperatingcharacteristic(sroc)曲線圖比較兩種ds產(chǎn)前篩查方案的診斷性能差異。2.采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(liquidchromatography-tandemmassspectrometry,lc-ms/ms)和氣相色譜與質(zhì)譜技術(gaschromatography-massspectroscopy,gc-ms)整合檢測血清代謝物組份,所得數(shù)據(jù)通過主成分分析(principalcomponentanalysis,pca)、聚類分析和隨機森林圖分析(randomforestanalysis,rf)等生物信息學處理,建立ds妊娠母體血清代謝物組學診斷模型。以p0.05且差異倍數(shù)在1倍以上作為具有統(tǒng)計學差異的判斷標準,采用welcht檢驗對篩選所得具有顯著差異的代謝化合物進行統(tǒng)計學分析,探討與唐氏綜合征可能相關的代謝途徑及相應代謝化合物。3.采用trizolls試劑提取血漿總rna,純化樣本并定量rna濃度后,進行rna標記和基因芯片雜交。雜交芯片經(jīng)掃描儀掃描,采集掃描數(shù)據(jù)并標準化處理,采用genepixprov6.0芯片分析軟件獲取ds妊娠和正常妊娠母體血漿microrna分子雜交實驗數(shù)據(jù)。并對相應結(jié)果進行聚類分析和火山圖分析,以p0.05且差異倍數(shù)在2倍以上作為具有統(tǒng)計學差異的標準,采用非配對t檢驗對表達差異顯著的microrna進行篩選和鑒定,獲得唐氏妊娠母體血漿中異常表達的microrna分子。4.采用westernblot方法對前期血清蛋白組學技術篩選獲得的dgtpase、β2-gpi、cfhr1、kng1四種蛋白標志物在ds妊娠母體血清中的表達水平進行驗證;同時,基于trfia技術構(gòu)建dgtpase、β2-gpi和kng1三種蛋白質(zhì)標志物的免疫學檢測方法,并對新建的檢測方法進行方法學評價;通過臨床標本檢測,初步建立三種血清蛋白標志物在正常孕婦血清中的參考值和唐氏孕婦中的陽性區(qū)間。結(jié)果1.sts和ins對ds產(chǎn)前篩查性能的meta分析①系統(tǒng)檢索數(shù)據(jù)庫共獲得文獻499篇,經(jīng)嚴格篩選與鑒別,最終共計18篇文獻被納入本次meta分析研究,涉及樣本183,998例。其中應用于sts和ins分析的文獻分別為13篇和6篇。②meta-disc軟件分析顯示,sts檢測的合并敏感性為0.77(95%ci=0.73~0.81),合并特異性為0.94(95%ci=0.94~0.94),陽性似然比(positivelikelihoodratio,plr)、陰性似然比(negativelikelihoodratio,nlr)分別為9.78(95%ci=6.87~13.93)和0.26(95%ci=0.22~0.31),合并診斷比值比(diagnosticoddsratio,dor)為44.72(95%ci=30.77~65.01),sroc曲線圖的曲線下面積(theareaunderthecurve,auc)和q值分別為0.9064和0.8381。ins篩查的合并敏感性為0.93(95%ci=0.90~0.95),合并特異性為0.93(95%ci=0.93~0.93),plr和nlr分別為22.38(95%ci=12.47~40.14)和0.08(95%ci=0.05~0.11),合并dor值為289.81(95%ci=169.08~496.76),sroc曲線圖的auc和q值分別為0.9781和0.9337。③將sts和ins兩種篩查方案的sroc曲線整合于同一張圖上,結(jié)果顯示ins曲線明顯高于sts;二者z檢驗中auc比較的z統(tǒng)計量=3.957,p0.01,q值的z統(tǒng)計量=4.613,p0.01,提示ins在ds妊娠產(chǎn)前篩查方面的敏感性、plr、nlr和dor指標均明顯優(yōu)于sts。2.ds妊娠母體血清代謝組學診斷模型的建立和特異代謝標志物的篩選①正常孕婦(up組)和ds孕婦(dp組)質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)經(jīng)pca處理,結(jié)果顯示,對區(qū)分兩組貢獻最大的三種主成分comp1、comp2、comp3的貢獻比率分別為34.86%,10.46%和5.99%,三者之和為51.31%,顯著大于40%的判斷閾值,提示pca模型可將up和dp兩組標本明顯區(qū)分開,模型構(gòu)建比較穩(wěn)定。②兩組質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)的聚類分析圖顯示,up組標本大多聚集在左側(cè)區(qū)域,dp組標本大多聚集在中間偏右側(cè)區(qū)域,所得聚類分析模型可將up、dp兩組標本區(qū)分開。③兩組質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)的rf分析結(jié)果顯示,對組間分類貢獻靠前的代謝物主要有碳水化合物類、氨基酸類、血紅素代謝類、能量代謝類、脂質(zhì)代謝類和核苷酸代謝類等,該rf圖對兩組的預測準確性高達97%,組間分辨能力較強。④兩組質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)采用t檢驗統(tǒng)計分析,dp組共獲得193種差異顯著的母體血清代謝產(chǎn)物,其中含量升高的有16種,含量降低的有177種,它們分別涉及能量代謝通路、脂類代謝通路、氨基酸與多肽代謝通路、核苷酸代謝通路、血紅素代謝通路等多種代謝途徑。3.ds妊娠母體血漿microrna標志物的初步篩選①up和dp兩組血漿microrna雜交芯片掃描圖片顯示,各基因雜交位點清晰,無漏點、基因點位重疊現(xiàn)象或異常熒光出現(xiàn),基因點位的背景圖像清楚、色澤均勻,提示microrna芯片雜交結(jié)果可靠,滿足實驗要求。②up和dp兩組所獲microrna數(shù)據(jù)的聚類分析結(jié)果顯示,up組標本均聚集于橫坐標左側(cè),dp組則聚集于橫坐標右側(cè),各組內(nèi)部6例標本的含量相對較一致,區(qū)分度良好。③up和dp兩組所獲microrna數(shù)據(jù)經(jīng)火山圖和非配對t檢驗分析,在ds妊娠母體血漿中共篩選獲得135條表達差異顯著的microrna分子,其中表達顯著性升高的95條,表達顯著性降低的40條。4.ds妊娠母體血清新蛋白標志物的驗證及相關檢測方法的建立①westernblot結(jié)果顯示:與up組相比,dp組血清中的dgtpase、cfhr1和kng1的含量顯著升高(p0.01或p0.05),而β2-gpi的水平則顯著降低(p0.01),與前期蛋白組學研究結(jié)果一致,提示上述蛋白質(zhì)標志物有望用于ds產(chǎn)前篩查。②在dgtpase、β2-gpi和kng1的trfia檢測方法中,鼠源性包被一抗最適濃度分別為25μg/ml、10μg/ml和25μg/ml,兔源性游離二抗最適濃度分別為10μg/ml、5μg/ml和2.5μg/ml,eu3+標記抗兔檢測抗體的最適濃度分別為10μg/ml、5μg/ml和5μg/ml。dgtpase標準曲線方程式為:lg(y)=0.867lg(x)+lg1789,決定系數(shù)r2=0.992,β2-gpi標準曲線方程式為:lg(y)=1.009lg(x)+lg1164,決定系數(shù)r2=0.991,kng1標準曲線方程式為:lg(y)=0.982lg(x)+lg1579,決定系數(shù)r2=0.984。③dgtpase、cfhr1和kng1蛋白標志物trfia檢測方法的評價:dgtpase的trfia檢測方法最低檢測線為3.06ng/ml,批內(nèi)、批間的變異系數(shù)分別介于2.4~4.8%和6.8~10.3%之間,回收率介于96.9~102.8%,與常見血清蛋白的交叉反應率介于0.12~1.02%。β2-gpi的trfia檢測方法最低檢測線為3.91ng/ml,批內(nèi)、批間的變異系數(shù)分別介于3.5~5.0%和6.8~9.2%之間;回收率介于96.1~105.9%,與常見血清蛋白的交叉反應率介于0.11~0.91%之間,與abcam公司檢測試劑盒的相關性曲線方程式為y=1.005x+0.039,決定系數(shù)r2=0.996,p0.01。kng1的trfia檢測方法最低檢測線為2.16ng/ml,批內(nèi)、批間的變異系數(shù)分別介于3.5~5.5%和5.3~10.2%之間,回收率介于93.4~107.0%,與常見血清蛋白的交叉反應率也是介于0.08~1.20%之間,與abcam公司檢測試劑盒相關性曲線為y=0.993x+22.67,決定系數(shù)r2=0.994,p0.01。④dgtpase、β2-gpi和kng1三種蛋白在up組、常規(guī)篩查高危組和dp組中的濃度:dgtpase濃度分別為:40.9±1.7μg/ml、43.2±2.6μg/ml和95.6±4.4μg/ml,β2-gpi濃度分別為:215.9±13.6μg/ml、203.4±11.1μg/ml和103.8±1.4μg/ml,kng1濃度分別為84.3±1.3μg/ml、98.2±4.8μg/ml和231.9±8.2μg/ml。三種蛋白標志物含量在up和dp組之間、常規(guī)篩查高危組和dp組之間均有顯著差異(p0.01),在up組和常規(guī)篩查高危組之間無顯著差異(p0.05)。結(jié)論1.ins在唐氏篩查方面的診斷性能顯著優(yōu)于sts,但兩種篩查方案均存在較高的假陽性率。因此,有必要探索具有更高特異性和診斷效能的母體血液生物新標志物,以提高ds產(chǎn)前篩查實驗的診斷性能。2.成功建立了ds妊娠母體血清代謝組學診斷模型,篩選獲得一組含量差異顯著的代謝組學化合物,為ds妊娠中期產(chǎn)前篩查潛在母體代謝標志物篩選提供了新線索。3.ds妊娠或ds的發(fā)病機制可能涉及氨基酸類、血紅素代謝類、碳水化合物類、能量代謝類、脂質(zhì)代謝類和核苷酸代謝類等多種生化代謝通路的異常。4.篩選獲得一組ds妊娠特異相關的microrna分子,有望為ds妊娠中期產(chǎn)前篩查提供潛在的microrna標志物。5.ds妊娠或ds的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在部分基因表達調(diào)控異常,為ds發(fā)病機制中基因表達異常的探討提供了新思路。6.dGTPase、CFHR1、β2-GPI和KNG1四種血清蛋白質(zhì)可能是DS產(chǎn)前篩查潛在的蛋白標志物。7.創(chuàng)建了dGTPase、β2-GPI和KNG1等三種潛在蛋白標志物的TRFIA檢測方法,初步建立了三種蛋白在正常妊娠和DS妊娠母體血清中的濃度參考范圍,有望為唐氏綜合征無創(chuàng)產(chǎn)前篩查提供母體血液潛在蛋白新標志物和檢測新方法。
【關鍵詞】：唐氏綜合征 生物標志物 代謝組學 MicroRNA 時間分辨熒光免疫分析
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R714.5;R446.6
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-12
• 中文摘要12-18
• 第一章 前言18-21
• 第二章 STS和INS在DS產(chǎn)前篩查中診斷性能的Meta分析21-37
• 2.1 材料和方法21-24
• 2.2 結(jié)果24-32
• 2.3 討論32-36
• 2.4 小結(jié)36-37
• 第三章 DS妊娠母體血清代謝組學研究37-55
• 3.1 材料和方法37-39
• 3.2 結(jié)果39-49
• 3.3 討論49-54
• 3.4 小結(jié)54-55
• 第四章 DS妊娠母體血漿microRNA標志物的初步篩選55-72
• 4.1 材料和方法55-58
• 4.2 結(jié)果58-68
• 4.3 討論68-71
• 4.4 小結(jié)71-72
• 第五章 DS妊娠母體血清蛋白新標志物驗證及時間分辨熒光免疫檢測方法建立 . 695.1 材料和方法72-99
• 5.1 材料和方法72-79
• 5.2 結(jié)果79-93
• 5.3 討論93-97
• 5.4 小結(jié)97-99
• 全文結(jié)論99-100
• 參考文獻100-108
• 文獻綜述DS妊娠早期產(chǎn)前篩查研究進展108-121
• 參考文獻119-121
• 攻讀博士學位期間的研究成果121-122
• 致謝122

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Metabolomics:a novel approach to identify potential diagnostic biomarkers and pathogenesis in Alzheimer's disease[J];Neuroscience Bulletin;2012年05期

  本文關鍵詞：唐氏綜合征產(chǎn)前篩查母體血液生物新標志物篩選及檢測方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：369063