本文關(guān)鍵詞：抗癌蛋白AC-01對大腸癌細胞的影響及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景進入21世紀以來,我國城鄉(xiāng)居民的生活水平大幅度提高,大腸癌也逐漸出現(xiàn)了城市化、年輕化的特點,與國外大腸癌發(fā)病平均年齡相比,中國的平均發(fā)病年齡要低10歲,比21世紀前的發(fā)病年齡大幅度提前。因此對于我國醫(yī)療界提出了巨大的挑戰(zhàn),尋求更有效的預(yù)防和治療方法迫在眉睫。但是結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展具備多基因、多步驟、多階段的特點。手術(shù)治療作為目前首選的治療方法,在大腸癌治療策略中的地位異常重要,但囿于手術(shù)技術(shù)及手術(shù)器械改良困難；而化學(xué)治療、放射治療部分彌補了手術(shù)治療的不足,但其嚴重的化療副反應(yīng)及過強的放療副損傷卻限制了其在臨床中的應(yīng)用。而目前新興的基因治療卻由于腫瘤細胞生物學(xué)的異型性及基因遺傳的不穩(wěn)定性,決定了從基因方面研究及治療具體腫瘤,也將會是一項異常艱巨的任務(wù)。但是,這畢竟是腫瘤治療領(lǐng)域中的里程碑式的進展,醫(yī)療工作者正不畏艱辛,努力挑戰(zhàn)。研制新的抗腫瘤藥物及其對腫瘤基因的影響機制,這是擺在科研工作者面前的重要研究課題�？拱┑鞍�(anticancer protein)是隨著近年來腫瘤研究的不斷進展,以及基于免疫和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展,被新近提出的一類腫瘤治療物質(zhì)總稱,也是一種新興的腫瘤治療策略,已成為目前腫瘤治療中的一個新熱點�？鼓[瘤蛋白特點為分子質(zhì)量小,極易穿透瘤細胞,具有較強的穩(wěn)定性,可以通過提高免疫應(yīng)答、抑制腫瘤血管形成、直接誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡或阻滯腫瘤細胞周期等作用方式抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。本課題組通過前期實驗研究發(fā)現(xiàn)了一個人類功能未知的新基因,其對結(jié)腸癌細胞系LoVo細胞存在有絲分裂抑制作用,其編碼蛋白與未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response, UPR)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)存在一定相關(guān)性,故將其命名為AC-01,并申請了國家自然基金資助,本實驗即為該國家自然科學(xué)基金(81172383)課題《AC-01：一種新的抗癌蛋白,生物治療大腸癌及其URP和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究》.(2012/01至2015/12.)的分課題之一。但是,根據(jù)目前已取得的研究成果,AC-01蛋白對大腸癌的作用機制仍未明確,結(jié)合碩士期間成果及大量文獻,考慮其可能通過抑制人大腸癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,激活其下游信號的傳遞及相關(guān)基因的表達,從而促進腫瘤的凋亡,抑制腫瘤的生長。在哺乳動物細胞內(nèi),脂類、糖類及蛋白質(zhì)合成及修飾的進行需要一個重要場所,這個場所就叫內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個相對比較敏感的膜性細胞器,它可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣的貯存與釋放,從而起到調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的鈣離子濃度的功能。當各種因素(生理性或病理性)誘發(fā)細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡,使細胞內(nèi)鈣離子濃度改變,以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊/錯誤折疊蛋白增加,最終產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。ERS進而激活細胞內(nèi)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)。UPR主要的表現(xiàn)是新生蛋白的合成減少、未折疊蛋白的降解及折疊增加,進而造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力減輕,使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)得到恢復(fù)。但有時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過于強烈或持久而不能通過減少新生蛋白合成使得其穩(wěn)態(tài)恢復(fù)時,UPR還可啟動凋亡途徑：激活細胞內(nèi)凋亡信號直接將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能恢復(fù)的細胞“處死”。細胞凋亡通路可以分為外源性途徑及內(nèi)源性途徑,其中外源性途徑指活化細胞內(nèi)凋亡受體,內(nèi)源性指損傷細胞內(nèi)線粒體。近年研究顯示,后者(通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激—UPR--細胞凋亡)是多種疾病發(fā)病的重要機制。UPR信號的接收并傳遞需要跨膜感應(yīng)蛋白的參與,主要有3個,分別是蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子-6(activating transcription factors-6, ATF-6)、肌醇酶1(inositol requiring enzyme-1,IRE-1)。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沒有被激活或保持穩(wěn)態(tài)時,葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78, GRP78)結(jié)合在PERK、ATF-6的L端,跨膜感應(yīng)蛋白處于無活性狀態(tài)；當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被激活而處于應(yīng)激狀態(tài)時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊/錯誤折疊蛋白增加,與ATF-6、PERK的L端解離,跨膜感應(yīng)蛋白(ATF-6、 PERK)被激活,同時GRP78與未折疊蛋白質(zhì)結(jié)合,直接激活I(lǐng)RE-1。于是跨膜感應(yīng)蛋白通路被激活,產(chǎn)生UPR:ATF-6、PERK、IRE-1分別激活其相應(yīng)的下游信號傳導(dǎo)通路及相關(guān)基因的表達,誘導(dǎo)細胞凋亡。最近研究表明,PERK通路的相關(guān)信號因子包括ATF-4、GADD34及CHOP等,它們的激活在細胞凋亡的過程中起到了重要作用。同樣地,當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不強烈時,PERK通路的主要機制是直接抑制蛋白合成,降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力,從而促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)恢復(fù)。PERK通路還可間接的通過促進e1F-2α磷酸化來達到抑制蛋白質(zhì)合成的作用。以上通路還可以通過STAT3信號通路介導(dǎo)細胞凋亡,調(diào)控cyclinD1、CDK2、MMP2、MMP9的表達。從而調(diào)節(jié)大腸癌細胞的血管形成及凋亡。Stat3是轉(zhuǎn)錄信號傳導(dǎo)子與激活子家族(signal transducers and activators of transcdption, STAT)的重要成員,目前定義為癌基因。STAT3信號傳導(dǎo)通路與腫瘤細胞的生物化學(xué)特性(增殖、分化及凋亡)密切相關(guān),該通路持續(xù)激活可導(dǎo)致細胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。本人碩士課題研究《STAT3短發(fā)夾RNA的構(gòu)建及其對人結(jié)腸癌HCT116細胞增殖和侵襲的實驗研究》中,利用RNAi特異性沉默結(jié)腸癌HCT116細胞中STAT3,進而觀察在RNA干擾結(jié)腸癌HCT116細胞中的STAT3基因后,結(jié)腸癌細胞生長、增殖及凋亡的變化；最終證實通過RNAi技術(shù)抑制STAT3mRNA的表達,有效地抑制癌細胞增殖,使結(jié)腸癌細胞阻滯于GO.G1期并誘導(dǎo)其凋亡,同時腫瘤細胞侵襲能力明顯降低。因此,我們推測AC-01蛋白通過調(diào)節(jié)大腸癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激,調(diào)控UPR信號通路,進而影響癌細胞的存活、腫瘤演進、血管形成及凋亡,進而抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。本實驗期望通過體內(nèi)和體外實驗,深入探討抗癌蛋白AC-01對大腸腫瘤細胞生物學(xué)特性所產(chǎn)生的影響,以及產(chǎn)生該影響的生物機制,為AC-01應(yīng)用于大腸癌的生物治療提供實驗證據(jù)。第一部分 人大腸癌細胞中AC-01的表達及其與STAT3的關(guān)系目的臨床收集人大腸癌標本,研究AC-01在大腸癌中的表達及作用。方法在前期研究基礎(chǔ)提示STAT3為促癌基因的基礎(chǔ)上,首先利用前期所制備的多克隆抗體,首先對該蛋白在大腸組織內(nèi)的表達特征進行了觀察,免疫組化技術(shù)檢測AC-01在大腸組織中的分布及表達。臨床收集人大腸癌組織標本,標本分為八組,每組分腫瘤與癌旁組織,應(yīng)用Western blot法檢測八組中AC-01及STAT3、 pSTAT3的蛋白表達并進行比較。結(jié)果免疫組化技術(shù)檢測AC-01在大腸組織中的分布及表達,結(jié)果提示AC-01蛋白在人的正常大腸組織存在表達。人大腸癌組織標本中,腫瘤組織中AC-01蛋白表達低于癌旁組織。Western blot法檢測分析結(jié)果表明,各組的腫瘤組織的AC-01蛋白表達低于癌旁組織,腫瘤組織組與癌旁組織組相比AC-01蛋白表達降低有顯著性差異(Z=-2.521,P=0.012)；腫瘤組織的STAT3蛋白表達高于癌旁組織,腫瘤組織組與癌旁組織組相比STAT3蛋白表達升高存在統(tǒng)計學(xué)差異(Z=-2.380P=0.017)；腫瘤組織的pSTAT3蛋白表達高于癌旁組織,腫瘤組織組與癌旁組織組相比pSTAT3蛋白表達升高有顯著性差異(Z=-2.521 P=0.012)；腫瘤組織中AC-01蛋白與pSTAT3蛋白表達呈負相關(guān),統(tǒng)計學(xué)有顯著性意義(相關(guān)系數(shù)rs=-0.671,P=0.004)。結(jié)論本實驗研究表明：①人大腸腫瘤中AC-01蛋白表達水平低于正常組織；②人大腸腫瘤中STAT3. pSTAT3蛋白表達水平均高于正常組織。③人大腸腫瘤中AC-01蛋白表達水平與pSTAT3蛋白表達水平為負相關(guān),存在統(tǒng)計學(xué)意義。綜合以上,根據(jù)STAT3為促癌基因的前期研究結(jié)果,由此推測AC-01為抗癌蛋白。第二部分 構(gòu)建并鑒定載體及穩(wěn)定細胞株實驗一構(gòu)建靶向AC-01的過表達載體及shRNA表達載體目的體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌LOVO細胞株,提取質(zhì)粒,構(gòu)建過表達pBabe-puro-AC-01載體,同時設(shè)計并構(gòu)建以AC-01為靶基因的pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表達載體,最終構(gòu)建穩(wěn)定細胞株。方法體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌LOVO細胞株,根據(jù)NCBI提供的AC-01基因序列(NCBI登錄號為XM 006714717)進行分析,以攜帶AC-01基因的質(zhì)粒為模板,通過PCR擴增出AC-01基因的編碼序列,構(gòu)建了pBabe-puro-AC-01過表達載體。根據(jù)shRNA的設(shè)計原則,設(shè)計合成1個可干擾序列,及1個陰性對照序列,構(gòu)建pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表達載體,并對其進行酶切鑒定和測序鑒定。最后抽提質(zhì)粒。結(jié)果體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌LOVO細胞株,設(shè)計合成AC-01基因的1個可干擾序列及陰性對照序列,成功構(gòu)建了pBabe-puro/AC-01過表達載體及pSUPERretro-puro/AC-Ol/RNAi表達載體。使用堿裂解法成功完成pBaBe-Puro, pBabe-puro-AC-01, pSUPERretro-puro, pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi, PIK純凈質(zhì)粒抽提,所得質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測序鑒定,證實了干擾質(zhì)粒中含有目的基因的序列,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。實驗二 構(gòu)建穩(wěn)定細胞株并鑒定目的篩選最高效序列AC-01/RNAi,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染LOVO細胞株,篩選保留穩(wěn)定細胞株,鑒定穩(wěn)定細胞株并檢測AC-01基因表達。方法使用脂質(zhì)體法將pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表達載體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌LOVO細胞系,轉(zhuǎn)染細胞分為4組,干擾對照組、AC-01/RNAi-1組、AC-01/RNAi-2組、AC-01/RNAi-3組,細胞轉(zhuǎn)染72h后,應(yīng)用RT-PCR法檢測四組的AC-OlmRNA表達,并進行比較篩選最高效序列組；Western blot法檢測各組AC-01蛋白表達改變并進行比較；篩選最高效序列AC-01/RNAi。磷酸鈣法制備逆轉(zhuǎn)錄病毒,pBabe-puro/AC-01質(zhì)粒及pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi質(zhì)粒已病毒為載體對LOVO細胞進行感染,感染結(jié)束后加入嘌呤霉素篩選陽性克隆,收集穩(wěn)定細胞株,分為LOVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四組,RT-QPCR擴增穩(wěn)定細胞株,western blot檢測穩(wěn)定細胞株的AC-01蛋白質(zhì)并進行比較。分析轉(zhuǎn)染后的效果。結(jié)果AC-01的RNA干擾重組體成功轉(zhuǎn)染LOVO細胞后。RT-PCR法檢測結(jié)果顯示通過FTC-2000A檢測各樣本Ct值,三組間AC-01mRNA表達差異有顯著性意義(P=0.027),其中AC-01/RNAi-2組AC-01基因表達量最高,AC-01/RNAi-3組次之,AC-01/RNAi-1組AC-01基因表達量最低。結(jié)合柱狀圖顯示AC-01/RNAi-1組的AC-01mRNA表達最低,因此認為AC-01/RNAi-1組序列效果最佳。Westernblot法檢測結(jié)果顯示四組間AC-01蛋白表達差異有顯著性意義(P=0.016),AC-01mRNA的表達由高到低：干擾對照組AC-01/RNAi-2組AC-01/RNAi-3組AC-01/RNAi-1組。結(jié)合柱狀圖顯示AC-01/RNAi-1組的AC-01蛋白表達最低,因此認為AC-01/RNAi-1組序列效果最佳。成功將AC-01質(zhì)粒及AC-01/RNAi-1質(zhì)粒通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染LOVO細胞后分為LOVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四組。Western blot法檢測分析結(jié)果表明,四組間AC-01蛋白表達差異有顯著性意義(P=0.016),AC-01蛋白的表達由高到低：LOVO-AC-01組LOVO-scramble組LOVO-vector組LOVO-AC-01/RNAi組。結(jié)合柱狀圖顯示LOVO-AC-01組的AC-01蛋白表達升高,LOVO-AC-01/RNAi組的AC-01蛋白表達降低。結(jié)論成功構(gòu)建過表達pBabe-puro-AC-01載體及pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表達載體,篩選得到最高效序列AC-01/RNAi-1質(zhì)粒,最終構(gòu)建穩(wěn)定細胞株,并成功驗證。第三部分 AC-01對大腸癌細胞生物學(xué)特性的影響目的探討AC-01對人結(jié)腸癌LOVO細胞增殖、分化、凋亡及侵襲性的影響。方法將AC-01質(zhì)粒及AC-01/RNAi-1質(zhì)粒通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染LOVO細胞,分為LOVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四組,①激光共聚焦觀察轉(zhuǎn)染陽性細胞和轉(zhuǎn)染陰性細胞,并比較其細胞核、形態(tài)、及細胞數(shù)；②四氮唑藍比色還原法(MTT法)檢測AC-01對LOVO細胞生長的抑制效應(yīng),并通過RNA干擾后比較其變化；③Transwell體外侵襲實驗進行癌細胞體外侵襲力分析。④劃痕實驗分別于劃痕后Oh、12h、24h、36h每個孔隨機取4個視野拍照,觀察劃痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力,觀察比較四組細胞愈合能力的變化。⑤對四組細胞進行3D-Culture實驗,觀察其形態(tài)變化并進行對比。結(jié)果AC-01質(zhì)粒及AC-01/RNAi-1質(zhì)粒成功通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染LOVO細胞,分為LOVO-vector, LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四組,①激光共聚焦觀察轉(zhuǎn)染AC-01陽性細胞,與周圍對照細胞相比,細胞核顯著減��；AC-01轉(zhuǎn)染細胞表現(xiàn)為分化具有更多的突起,隨AC-01重組蛋白濃度的增加,大腸癌細胞系LoVo細胞計數(shù)顯著下降。②MTT法檢測結(jié)果表明：四組中OD平均值有顯著性差異(H=12.12,P=0.007),其相對增殖率亦有顯著性差異(H=12.00,P=0.0074)。根據(jù)細胞生長趨勢圖顯示LOVO-AC-01組中LOVO細胞增殖強度及速度均減弱,而LOVO-AC-01/RNAi組中LOVO細胞增殖強度及速度均增強；③侵襲實驗結(jié)果表明：四組中侵襲細胞數(shù)有顯著性差異(H=9.5848,P=0.02240.05)。根據(jù)柱狀圖顯示LOVO-AC-01組中LOVO侵襲細胞數(shù)減少,而LOVO-AC-01/RNAi組中LOVO侵襲細胞數(shù)增加。④劃痕實驗結(jié)果表明：LOVO-AC-01組的細胞愈合率則弱于其他三組,LOVO-AC-01/RNAi組的細胞愈合率強于其他三組。⑤3D-Culture實驗結(jié)果顯示：LOVO-vector組及LOVO-scramble組中LOVO細胞變化不明顯,LOVO-AC-01組的LOVO細胞表面觸角明顯收縮,表面變得平滑,LOVO-AC-01/RNAi組的細胞表面觸角明顯延長、增多,表面變得更加凹凸不平。結(jié)論本實驗研究表明：①AC-01蛋白可以特異性地抑制癌細胞的增殖及侵襲能力,同時促進癌細胞凋亡,且效果顯著；②通過特異性沉默AC-01基因表達,可以促進癌細胞增殖,增強其侵襲能力,且效果顯著；③AC-01對大腸癌細胞系LoVo細胞增殖的抑制作用具有劑量依賴性。④AC-01蛋白是一種抗癌蛋白,可能成為大腸癌臨床不良預(yù)后的一種分子標志,甚至成為大腸癌治療的靶目標。第四部分 AC-01對大腸癌細胞的作用機制研究目的探討AC-01通過調(diào)節(jié)大腸癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響LOVO細胞的存活、腫瘤演進、血管形成及凋亡的機制。方法由于該蛋白的分布特征,我們推測該蛋白的表達可能與大腸癌細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。因此,我們利用經(jīng)典的衣霉素(Tunicamycin)誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型,對應(yīng)激條件下該蛋白的表達特征進行了觀察,檢測AC-01蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志物GRp78、GADD的表達,了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與AC-01蛋白的關(guān)系。將AC-01質(zhì)粒及AC-01/RNAi-1質(zhì)粒通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染LOVO細胞,分為LOVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四組,通過實時熒光定量PCR的方法,采用Sybrgreer染料法,以管家基因為內(nèi)參基因,檢測在不同組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的標志物GRp78、PERK、XBP1、ATF6、cyclinD1、 CDK2的表達,并對數(shù)據(jù)進行比較。Western-blot檢測LOVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、 LOVO-AC-01/RNAi四組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的標志物GRp78、PERK、XBP1、 ATF6、eIF2α、p-eIF2α、cyclinD1、CDK2的表達,以及由此影響其下游基因蛋白stat3、p-stat3、MMP2、MMP9的表達。結(jié)果Biacore 3000檢測AC-01融合蛋白與Ca2+離子存在結(jié)合活性；Tunicamycin處理大腸癌細胞系LoVo導(dǎo)致細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后,GRp78和GADD的表達隨tunicamycin濃度升高而增加,而AC-01蛋白的表達隨tunicamycin濃度升高而減少。實時熒光定量PCR中,熒光擴增曲線呈平滑的S型,溶解曲線全部為單峰表明為特異性擴增。實驗結(jié)果提示：四組中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、cyclinD1、CDK2的表達有顯著性差異(均P0.05)。根據(jù)柱狀圖顯示LOVO-AC-01組中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、cyclinD1、CDK2的表達下調(diào),而LOVO-AC-01/RNA組中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、cyclinD1、CDK2的表達上調(diào)。Western-blot檢測結(jié)果提示：四組中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、eIF2α、 p-eIF2α、cyclinD1、CDK2、MMP2、MMP9的表達有顯著性差異(均P0.05),根據(jù)柱狀圖顯示LOVO-AC-01組中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、eIF2a, p-eIF2α、 cyclinD1、CDK2、MMP2、MMP9的表達均下調(diào),而stat3、p-stat3表達增高；LOVO-AC-01/RNA組中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、eIF2a、p-eIF2α、cyclinD1、 CDK2、MMP2、MMP91的表達均增強,而stat3、p-stat3表達下降。結(jié)論本實驗研究表明：①AC-01蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān),可能是抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的損傷保護性蛋白；②AC-O1蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響UPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(PERK-eIF2A通路、ATF6通路和IRE1-XBP1通路),從而影響大腸癌LOVO細胞的存活、腫瘤演進及凋亡機制。③AC-01進一步抑制stat3、p-stat3及其相關(guān)蛋白MMP2、MMP9,從而影響大腸癌LoVo細胞的增殖及腫瘤血管形成。第五部分 小鼠體內(nèi)實驗驗證AC-01對大腸癌細胞的影響目的通過動物實驗探討AC-01對大腸癌細胞的影響。方法分為LOVO-vector接種、LOVO-AC-01接種、LOVO-scramble接種、LOVO-AC-01/RNAi接種組。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染chickenB-actin-RFP-NEO表達載體。裸鼠腫瘤細胞異種移植試驗：雄性BALB/c裸小鼠皮下注射接種目標細胞,10毫克/公斤,每三天1次。腫瘤體積由長度(L)×寬度(W)2×0.5計算,用滑動卡尺測量和計算,自第七天后每三天記錄1次,40天后小鼠處以安樂死,腫瘤稱重,記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果隨著時間和組別對于腫瘤體積都是有影響的,這種影響有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.0001),組別和時間有交互作用。四組間,腫瘤重量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0295)。根據(jù)柱狀圖顯示,與對照組比較,LOVO-AC-01接種組中腫瘤生長速度下降,腫瘤的體積、重量均減少；而且LOVO-AC-01/RNAi接種組中腫瘤生長速度加快,腫瘤的體積、重量均明顯增加。結(jié)論本實驗研究表明：AC-01重組蛋白抑制裸小鼠體內(nèi)大腸腫瘤的形成和生長；而AC-01/RNAi促進小鼠體內(nèi)大腸腫瘤的形成和生長。
【關(guān)鍵詞】：AC-01 RNA干擾 結(jié)腸癌 增殖 侵襲 凋亡 AC-01 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 大腸癌 增殖 凋亡 信號通路 AC-01 裸小鼠 結(jié)腸癌 異種移植 生長 AC-01 STAT3 結(jié)腸癌 AC-01 載體 質(zhì)粒 結(jié)腸癌 酶切鑒定 測序鑒定 RNAi AC-01 質(zhì)粒 結(jié)腸癌 穩(wěn)定細胞株 RNAi
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 摘要3-14
• ABSTRACT14-30
• 前言30-41
• 參考文獻33-41
• 第一部分 人大腸癌細胞中AC-01的表達及其與STAT3的關(guān)系研究41-55
• 材料與方法41-47
• 結(jié)果47-52
• 討論52-53
• 參考文獻53-55
• 第二部分 構(gòu)建并鑒定載體及穩(wěn)定細胞株55-85
• 實驗一 構(gòu)建AC-01過表達載體及靶向AC-01的shRNA表達載體55-68
• 材料與方法55-66
• 結(jié)果66-68
• 實驗二 構(gòu)建穩(wěn)定細胞株并鑒定68-81
• 材料與方法68-75
• 結(jié)果75-81
• 討論81-84
• 參考文獻84-85
• 第三部分 AC-01對大腸癌細胞生物學(xué)特性的影響85-103
• 材料與方法85-88
• 結(jié)果88-94
• 討論94-100
• 參考文獻100-103
• 第四部分 AC-01對大腸癌細胞的作用機制研究103-127
• 材料與方法103-105
• 結(jié)果105-120
• 討論120-124
• 參考文獻124-127
• 第五部分 小鼠體內(nèi)實驗驗證AC-01對大腸癌細胞的影響127-134
• 材料與方法127-129
• 結(jié)果129-131
• 討論131-134
• 結(jié)論134
• 參考文獻134-136
• 綜述136-145
• 參考文獻142-145
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文145-146
• 致謝146-148
• 統(tǒng)計學(xué)審稿證明148

  本文關(guān)鍵詞：抗癌蛋白AC-01對大腸癌細胞的影響及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：369222