發(fā)布時間：2017-05-15 08:10

  本文關(guān)鍵詞：丙磺舒在全腦缺血復(fù)灌損傷中的作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：血管再通治療(如rtPA溶栓治療及機械取栓術(shù))仍然是治療急性缺血性腦血管疾病的唯一有效方法。然而,血管再通大腦恢復(fù)灌注過程中可能會導(dǎo)致血腦屏障破壞、鈣超載、氧自由基過飽和、嚴重水腫、出血轉(zhuǎn)化等不良后果,從而加重腦組織損傷,稱為腦缺血復(fù)灌損傷(cerebral ischemia/reperfusion (I/R) injury)。盡管各國政府投入大量的研究經(jīng)費,對于腦卒中缺血及復(fù)灌損傷病理機制的研究已經(jīng)取得了重要進展,并開發(fā)了一系列的藥物或分子蛋白,但向臨床應(yīng)用的有效轉(zhuǎn)化卻少有成功。因此,研究闡明腦卒中所致神經(jīng)損傷的病理機制、尋找新的有效的生物靶點、研發(fā)理想的治療藥物顯得尤為迫切。2000年P(guān)anchin等在脊椎動物體內(nèi)找到一類基因與無脊椎動物縫隙連接蛋白基因Innexin類似,被稱為Pannexin (Panx),其所表達的Panx蛋白包含三種亞型：Panx 1、Panx 2和Panx3.其中Panx1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有著非常廣泛的表達,而在神經(jīng)錐體細胞上的表達尤其豐富。隨后大量研究表明Panx蛋白可以在細胞膜上形成蛋白通道,介導(dǎo)細胞內(nèi)ATP釋放、細胞間鈣波傳遞、血管血流調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答等多種生理功能。病理狀態(tài)下參與炎癥、腫瘤、癲癇及腦缺血等多種疾病發(fā)生發(fā)展,提示該蛋白通道在人體的一系列生理病理過程中起著非常重要的作用。一系列的離體和在體研究也證實通過藥物阻斷Panx1通道或敲除Pannexn1基因可以明顯改善缺血損傷對離體神經(jīng)元或腦組織的傷害,減少小鼠局灶性腦缺血所致的梗死面積,并改善其神經(jīng)功能,提示Panx1通道可能是治療腦缺血復(fù)灌損傷的重要靶點。丙磺舒(Probenecid, PROB)被用于臨床治療痛風已有數(shù)十年,最近William Silverman的研究表明丙磺舒也是Panx1通道的特異性阻斷劑,體外研究表明其半抑制濃度(IC50)約為150州,即使非常低的濃度(1μM)對Panx1通道也有一定的抑制作用,而1mM濃度的丙磺舒可以完全抑制該通道。以往的研究也發(fā)現(xiàn)丙磺舒可以被用來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如神經(jīng)退行性疾病(帕金森病、阿爾茨海默病、Huntington病)、癲癇及腦缺血性疾病,認為丙磺舒作為有機陰離子轉(zhuǎn)運體抑制劑,可以抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)色氨酸降解代謝物(如犬尿酸,kynurenic acid, KYNA)的清除,從而增加其濃度。KYNA是離子型谷氨酸受體內(nèi)源性競爭性抑制劑,可以與NMDA受體上的甘氨酸位點發(fā)生作用,同時還可以抑制a7-煙酰胺乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptors, a7nAChR),從而減輕各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的興奮性毒性損傷。但研究也發(fā)現(xiàn),即使腹腔注射給予200mg/kg的丙磺舒對腦組織內(nèi)KYNA濃度的提高也非常有限,不足以阻斷興奮性受體NMDARs或a7nAChRs。單獨給予50mg/kg或2mg/kg的丙磺舒對腦缺血損傷也具有一定的保護作用,說明丙磺舒的神經(jīng)保護作用可能不是通過提高內(nèi)源性神經(jīng)保護劑,而是通過其他途徑而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。事實上丙磺舒可以通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng),作為Panxl通道阻滯劑可以直接與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生作用。然而,目前對于丙磺舒的這種直接保護作用的研究尚很缺乏,對于丙磺舒治療缺血腦損傷的合適給藥劑量、途徑亦缺乏深入的研究。研究目的：基于以上的研究背景,我們建立了大鼠全腦缺血復(fù)灌損傷模型,觀察丙磺舒對全腦缺血復(fù)灌損傷的可能保護作用,試圖解決以下問題：(1)通過不同劑量,不同時間及不同途徑給藥治療,明確丙磺舒對全腦缺血復(fù)灌損傷的保護作用；(2)探索丙磺舒治療腦缺血復(fù)灌損傷可能的最佳劑量水平,明確丙磺舒給藥治療的合適途徑；(3) 探討丙磺舒治療腦缺血復(fù)灌損傷的可能機制。通過我們的研究,為丙磺舒臨床治療缺血性腦血管疾病提供可靠的理論依據(jù)。第一部分丙磺舒對全腦缺血復(fù)灌損傷后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活的影響研究方法取體重280-350g的成年雄性SD大鼠。應(yīng)用四血管法(4-vessel occlusion, 4-VO)建立全腦缺血復(fù)灌損傷模型,缺血時間20min。在缺血前、缺血后經(jīng)靜脈、腹腔或灌胃給予不同劑量的丙磺舒治療,在復(fù)灌后7天處死大鼠,進行HE染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的死亡情況,比較不同劑量、途徑及方法對缺血后神經(jīng)元死亡保護作用的區(qū)別。結(jié)果(1)在缺血前10min經(jīng)靜脈給予0.1mg/kg, 1.0mg/kg或10mg/kg對全腦缺血復(fù)灌損傷后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡均有一定的保護作用,其中1mg/kg組保護最明顯。(2)缺血后10min和2h腹腔單次注射給藥同樣具有保護作用,但6h后單次給藥無明顯保護作用。缺血復(fù)灌后2h或6h連續(xù)給藥1周可以提高丙磺舒對海馬CA1神經(jīng)元的保護作用。(3)缺血前灌胃1周及缺血復(fù)灌2h后灌胃1周對缺血后海馬神經(jīng)元損傷均有保護作用。(4)不同途徑(靜脈、腹腔或灌胃)丙磺舒給藥對缺血損傷的保護作用無明顯影響。結(jié)論：缺血前及缺血后丙磺舒給藥對全腦缺血復(fù)灌損傷均有一定的保護作用。丙磺舒的保護作用不是劑量依賴的,與缺血后起始給藥的時間密切相關(guān),不同途徑給藥并不影響丙磺舒的療效。第二部分丙磺舒對全腦缺血復(fù)灌損傷保護作用的可能機制研究研究方法在缺血前給予lmg/kg丙磺舒,分別在缺血后24h,48h,72h及7天處死大鼠,取腦或提取海馬組織,進行熒光免疫組化檢查和western blot檢查,觀察缺血復(fù)灌后大鼠海馬區(qū)組織蛋白酶Cathepsin B,炎癥反應(yīng)細胞(GFAP,Iba-1)及蛋白Calpain-1,Hsp70的表達變化及丙磺舒的干預(yù)作用。同時觀察比較缺血后2h及6h單次給藥組和連續(xù)給藥7天組海馬區(qū)的炎癥反應(yīng)細胞表達變化情況。離體培養(yǎng)新生大鼠海馬原代神經(jīng)元,氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷(OGD/R)后觀察丙磺舒對神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度的影響。結(jié)果(1)缺血復(fù)灌損傷后海馬區(qū)神經(jīng)元組織蛋白酶Cathepsin B的表達明顯增高,提示溶酶體膜的破壞,丙磺舒治療可以抑制Cathepsin B的表達；(2)丙磺舒可以抑制缺血后Calpain-1的表達,相反可以提高保護性熱休克蛋白Hsp70的表達；(3)丙磺舒可以抑制OGD/R后神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度的升高；(4)腦缺血復(fù)灌損傷后,海馬區(qū)的炎癥反應(yīng)細胞明顯增加,缺血后6h單次給藥可以輕度抑制炎性反應(yīng)細胞的增加,但連續(xù)給藥7天可以明顯抑制海馬區(qū)炎癥反應(yīng)細胞的增加及活化。結(jié)論：丙磺舒可以抑制腦缺血損傷后急性期的鈣超載,進而抑制鈣蛋白酶Calpain-1的表達,減少溶酶體組織蛋白酶Cathepsin B的釋放,同時提高熱休克蛋白Hsp70的表達,丙磺舒還可以抑制缺血損傷后中晚期的炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。
【關(guān)鍵詞】：缺血復(fù)灌損傷 Pannexin通道 丙磺舒 鈣蛋白酶 炎癥
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 縮略語表15-19
• 引言19-26
• 第一部分 丙磺舒對全腦缺血復(fù)灌損傷后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活的影響26-46
• 1.1 前言26-27
• 1.2 實驗材料27-29
• 1.3 實驗方法29-34
• 1.4 實驗結(jié)果34-43
• 1.5 討論43-45
• 1.6 小結(jié)45-46
• 第二部分 丙磺舒對全腦缺血復(fù)灌損傷保護作用的可能機制研究46-82
• 2.1 前言46-50
• 2.2 實驗材料50-57
• 2.3 實驗方法57-64
• 2.4 實驗結(jié)果64-76
• 2.5 討論76-81
• 2.6 小結(jié)81-82
• 總結(jié)及展望82-84
• 參考文獻84-92
• 綜述92-107
• 參考文獻102-107
• 作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果107-108

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本文編號：367232