Kruppel Like Factor 4（KLF4）是鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族KLF中的一員,在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。KLF4在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中由于所在組織類型不同而具有抑癌基因和癌基因的雙重功能。KLF4在細(xì)胞內(nèi)半衰期很短,其蛋白水平可受多種因素刺激而發(fā)生迅速變化,進(jìn)而造成細(xì)胞內(nèi)生理和病理反應(yīng)。這些調(diào)控大多通過(guò)蛋白翻譯后修飾介導(dǎo)。近年來(lái),去泛素化也作為調(diào)節(jié)蛋白水平和功能的一項(xiàng)重要的翻譯后修飾機(jī)制而被廣泛研究,于是我們想要進(jìn)一步探究去泛素化酶在KLF4蛋白調(diào)節(jié)中的作用。本實(shí)驗(yàn)中,我們?cè)谝粋�(gè)含有65個(gè)去泛素化酶（Deubiquitinating enzyme,DUB）的文庫(kù)中篩選出KLF4的首個(gè)去泛素化酶。首先我們將候選DUB分別在工具細(xì)胞U20S和乳腺癌細(xì)胞MCF7中過(guò)表達(dá),通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)KLF4的含量,篩選出在這兩種細(xì)胞中均影響KLF4蛋白水平的DUB。而后利用免疫共沉淀技術(shù),分析出通過(guò)與KLF4直接相互作用而對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)的DUB。采用以上的篩選策略,我們篩選出ATXN3可能是KLF4的一個(gè)去泛素化酶。而后,我們通過(guò)半衰期實(shí)驗(yàn)和泛素化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 ATXN3可通過(guò)減弱KLF4的泛素化... 

【文章來(lái)源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖２－?１去泛素化酶篩選流程圖??用文庫(kù)中的去泛素化酶（ＤＵＢ）表達(dá)載體分別穩(wěn)定、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ｕ２０Ｓ細(xì)胞和ＭＣＦ７??細(xì)胞

去泛素化酶取交集，獲得可能在各類細(xì)胞中廣泛存在的ＫＬＦ４的去泛素化酶。Ｄ．通??過(guò)ＩＰ篩選出能與ＫＬＦ４結(jié)合的去泛素化酶。??篩選的流程圖見(jiàn)圖２－１，其主要策略是關(guān)注ＫＬＦ４蛋白水平在各種去泛素化酶??過(guò)表達(dá)后的變化。我們首先分析了過(guò)表達(dá)６５種去泛素化酶的Ｕ２０Ｓ細(xì)胞和ＭＣＦ７??細(xì)胞中ＫＬＦ４的表達(dá)水平，篩選出上調(diào)Ｕ２０Ｓ細(xì)胞中ＫＬＦ４的去泛素化酶。與陰性??對(duì)照細(xì)胞系相比，我們?cè)冢保硞�(gè)去泛素化酶過(guò)表達(dá)的Ｕ２０Ｓ細(xì)胞系中觀察到ＫＬＦ４蛋??白水平上調(diào)（圖２－２?Ａ），這１３個(gè)去泛素化酶分別是：ＵＳＰ１４、ＵＳＰ８、ＵＳＰ４８、??ＵＳＰ２２、ＥＩＦ３Ｓ５、ＵＣＨＬ１、ＵＳＰ４６、ＵＳＰ５０、Ｊ０ＳＤ２、ＵＳＰ２０、０ＴＵＤ４、ＡＴＸＮ３、??ＵＣＨＬ５。另外，在ＭＣＦ７細(xì)胞中，我們?cè)冢保硞�(gè)不同的去泛素化酶過(guò)表達(dá)時(shí)觀察到??ＫＬＦ４蛋白水平增加（圖２－２?Ｂ），這１３個(gè)去泛素化酶分別是：ＡＴＸＮ３、ＢＡＰ１、??ＢＲＣＣ３、Ｃ０ＰＳ６、ＣＹＬＤ、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ３０、０ＴＵＤ５、ＵＳＰ３６、ＵＳＰ４８、??ＵＳＰ５、ＵＳＰ１０。為了得到在不同種細(xì)胞中廣泛發(fā)揮作用的ＫＬＦ４的去泛素化酶，我??們對(duì)這兩種細(xì)胞系的篩選結(jié)果取交集，Ｖｅｎｎ圖顯示ＡＴＸＮ３和ＵＳＰ４８可同時(shí)在這??兩種細(xì)胞中發(fā)揮作用（圖２－２?Ｃ）。??由于酶與底物的結(jié)合依賴于它們的直接相互作用

?結(jié)果??了?ＡＴＸＮ３與ＫＬＦ４之間的相互作用（圖２－３Ａ．Ｂ）。說(shuō)明ＡＴＸＮ３可以直接作用于??ＫＬＦ４，從而對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)。??ＷＣＬ?ＩＰ：?Ｆｌａｇ??ＧＦＰ－Ｃｔｒｌ?＋?＋??ＧＦＰ－ＫＬＦ４?＋?＋??Ｆ／Ｈ－ＡＴＸＮ３?＋?＋?＋?＋??ＧＦＰ?５??Ｆｌａｇ?＾■？一?一??圖２－?３?ＡＴＸＮ３與ＫＬＦ４相互作用??生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ＨＥＫ２９３細(xì)胞以３?ｘ?１〇５／孔接種于６孔板。培養(yǎng)過(guò)夜使細(xì)胞貼壁后，??用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ?２０００轉(zhuǎn)入帶ＧＦＰ標(biāo)簽的ＫＬＦ４和帶Ｆｌａｇ／ＨＡ標(biāo)簽的ＡＴＸＮ３表達(dá)??載體，２４小時(shí)后收取細(xì)胞，用ＮＰ－４０裂解液提取蛋白，而后用帶抗Ｈａｇ抗體的瓊??脂糖珠ＩＰ富集蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測(cè)富集蛋白中ＧＦＰ的含量。??綜上所述，我們證實(shí)了去泛素化酶ＡＴＸＮ３是通過(guò)與ＫＬＦ４相互作用，改變??Ｕ２０Ｓ和ＭＣＦ７細(xì)胞內(nèi)ＫＬＦ４含量。由此我們初步篩選出ＡＴＸＮ３可能為ＫＬＦ４的去??泛素化酶。??２．尋找ＡＴＸＮ３與ＫＬＦ４相互作用的區(qū)域??２．１．?ＡＴＸＮ３分子上與ＫＬＦ４結(jié)合的區(qū)域??ＡＴＸＮ３是去泛素化酶家族ＭＪＤ中的一員。ＭＪＤ家族的全稱為Ｍａｃｈａｄｏ??ＪｏｓｅｐｈｉｎＤｏｍａｉｎＰｒｏｔｅｉｎ，其成員的共有的結(jié)構(gòu)特性是氨基端存在一個(gè)由大約１８０個(gè)??氨基酸殘基構(gòu)成的Ｊｏｓｅｐｈｉｎ結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域呈ａ螺旋結(jié)構(gòu)，是一類半胱氨酸蛋白??酶結(jié)構(gòu)域

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]楔橫軋輥剪制坯力的研究[J]. 柳傳,束學(xué)道,胡斌.  熱加工工藝. 2015(11)
[2]Deubiquitinating enzyme regulation of the p53 pathway: A lesson from Otub1[J]. Xiao-Xin Sun,Mu-Shui Dai.  World Journal of Biological Chemistry. 2014(02)



本文編號(hào)：3591442