本文關(guān)鍵詞：一氧化氮（NO）對(duì)肌損傷炎癥反應(yīng)的干擾效應(yīng)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：急性骨骼肌損傷是生活中常見(jiàn)損傷之一,包括機(jī)械性損傷,生化毒素,擠壓傷、過(guò)度負(fù)荷、拉傷、挫傷等。無(wú)論哪種原因造成的損傷,傷后早期均表現(xiàn)為損傷部位的炎癥反應(yīng)：損傷、壞死的肌纖維釋放促炎信號(hào),誘導(dǎo)外周炎癥細(xì)胞(以中性粒細(xì)胞、單核、巨噬細(xì)胞為主)向損傷肌組織的移動(dòng)及肌內(nèi)浸潤(rùn),以吞噬壞死肌細(xì)胞和崩解的組織碎片,同時(shí)分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子,維持肌內(nèi)炎癥反應(yīng)并激活肌衛(wèi)星細(xì)胞,活化的成肌細(xì)胞持續(xù)增殖、分化形成新的肌管以修復(fù)損傷的肌纖維,完成肌肉再生。肌內(nèi)的炎癥反應(yīng)有助于損傷潰變肌纖維的清除,炎性環(huán)境也有助于肌纖維的再生修復(fù)。然而,劇烈、持續(xù)的肌內(nèi)炎癥反應(yīng)易導(dǎo)致肌組織局部血腫或腫脹、肌內(nèi)壓力增加,抑制成肌細(xì)胞增殖,甚至損傷正常的肌纖維,導(dǎo)致愈合期延長(zhǎng)、甚至出現(xiàn)瘢痕性修復(fù),影響患者的生存質(zhì)量[6]。充分研究骨骼肌損傷機(jī)制,探討如何減輕肌損傷后的炎癥反應(yīng),協(xié)調(diào)炎癥和肌再生的關(guān)系,從而提高愈合質(zhì)量是骨骼肌損傷研究領(lǐng)域的重要課題。一氧化氮(Nitric oxide, NO)是在一氧化氮合酶(NOS)作用下,由L-精氨酸合成的信號(hào)分子。在骨骼肌損傷和再生過(guò)程中,NO通過(guò)下述途徑促進(jìn)骨骼肌的再生修復(fù)：ⅰ)促進(jìn)成肌細(xì)胞的活性、增殖及分化；ⅱ)通過(guò)擴(kuò)血管作用增加損傷區(qū)血供(為損傷區(qū)提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣)；ⅲ)上調(diào)葡萄糖載體GLUT4水平,提高肌組織的葡萄糖攝��；ⅳ)上調(diào)sirtuin-1-依賴性的線粒體合成,提升肌肉的能量代謝。通過(guò)促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡、抑制黏附分子(如[CAM, E-selectin, P-selectin)表達(dá),肌源性NO能夠降低肌損傷后的炎性反應(yīng),降低中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的肌細(xì)胞壞死溶解,降低過(guò)氧化物濃度和反應(yīng)性中間體的形成。作為成肌細(xì)胞的力學(xué)增值信號(hào)分子,NO參與骨骼肌損傷后的衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖及分化,促進(jìn)損傷肌組織修復(fù)。目前關(guān)于NO對(duì)肌損傷后炎癥反應(yīng)的作用尚存在爭(zhēng)議：Hickey等證實(shí)iNOS基因敲除小鼠的損傷骨骼肌內(nèi)炎癥細(xì)胞的滲出減少；McCafferty和Rigamonti則認(rèn)為肌肉損傷后iNOS來(lái)源的NO可以降低淋巴細(xì)胞滲出；Rovere-Querini P課題組的研究發(fā)現(xiàn)iNOS基因敲除小鼠損傷肌組織內(nèi)炎癥細(xì)胞滲出明顯多于對(duì)照組。本課題組前期的體外研究證實(shí)[19],NO的拮抗劑L-NAME促進(jìn)C2C12細(xì)胞自身抗原及TLR3的表達(dá),而SNP (NO供體)則抑制上述分子的表達(dá)。這表明NO可能參與下調(diào)骨骼肌炎癥反應(yīng)。為進(jìn)一步分析NO對(duì)損傷誘導(dǎo)的骨骼肌炎癥反應(yīng)的干擾作用,本研究利用Notexin制備小鼠急性肌損傷模型,化學(xué)干擾體內(nèi)NO水平,分析損傷骨骼肌的自身抗原(Mi-2、HARS、 DNA-PKcs和Ku-70)和TLRs(TLR3和T-TLR7)基因及蛋白表達(dá),單核/巨噬細(xì)胞的肌內(nèi)滲出及凋亡,CD8+T細(xì)胞的肌內(nèi)滲出及再生肌纖維MHC-Ⅰ的表達(dá),損傷肌組織內(nèi)重要的細(xì)胞因子(TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-10)和趨化因子(MIP-1α、 MCP-1、MCP-3)的表達(dá)差異。生理?xiàng)l件下,肌衛(wèi)星細(xì)胞和成熟的肌纖維均缺乏MHC分子表達(dá)。但有研究證實(shí),體外分離培養(yǎng)的人成肌細(xì)胞能表達(dá)MHC-Ⅰ(人類白細(xì)胞抗原I,HLA classI),促炎的細(xì)胞因子(女PIFN-γ, TNF-α, IL-1α, IL-1β,或MIP-1α)會(huì)進(jìn)一步上調(diào)成肌細(xì)胞的HLA-Ⅰ表達(dá)。接受IFN-γ刺激后,成肌細(xì)胞和分化肌管均表達(dá)MHC-Ⅱ分子(HLA class-Ⅱ)。因此有學(xué)者指出,骨骼肌細(xì)胞是一種兼職的(non-professional)抗原呈遞細(xì)胞(APC)。有關(guān)骨骼肌細(xì)胞免疫特性的研究均選用人的成肌細(xì)胞及分化肌管。罕有文獻(xiàn)報(bào)道目前廣泛應(yīng)用的成肌細(xì)胞株(如C2C12,L6細(xì)胞)、以及來(lái)源及擴(kuò)增更為便利的小鼠原代成肌細(xì)胞是否表達(dá)MHC分子并具備APC功能。本課題嘗試將體外增殖或分化培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞置于IFN-y誘導(dǎo)的炎性環(huán)境中,檢測(cè)分析IFN-y刺激培養(yǎng)的成肌細(xì)胞/分化肌管是否具備炎性細(xì)胞特性(能否上調(diào)MHC-Ⅰ,并表達(dá)MHC-Ⅱ?)NLRP3炎癥小體(inflammasome)是先天免疫和獲得免疫的聯(lián)系分子。APC細(xì)胞內(nèi)激活的炎癥小體所釋放的IL-1β,IL-18,及IL-33以自分泌方式促進(jìn)APC細(xì)胞提高抗原呈遞能力,上調(diào)共刺激分子和MHC-Ⅱ表達(dá),從而激活抗原特異的T、B細(xì)胞反應(yīng)[26,27,28]。炎癥小體的正�；罨诰S持機(jī)體免疫系統(tǒng)穩(wěn)定中起了重要作用,但持續(xù)活化則會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥和自身免疫疾病的發(fā)生[29,30]。Mishra等發(fā)現(xiàn)NO能抑制NLRP3炎癥小體的活化,減少IL-1β的分泌從而抑制由肺結(jié)核的產(chǎn)生免疫反應(yīng)；Kairui Mao證實(shí)NO可抑制NLRP3炎癥小體的過(guò)度活化。盡管炎癥小體與自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,多發(fā)性硬化)的相關(guān)性已被廣泛探討,卻未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道炎癥小體是否影響骨骼肌炎癥的發(fā)生和發(fā)展。為探討炎性環(huán)境中的肌細(xì)胞是否表達(dá)炎癥小體并分泌相關(guān)的細(xì)胞因子,并進(jìn)一步明確NO是否干擾肌細(xì)胞內(nèi)炎癥小體的激活,我們嘗試?yán)肐FN-γ刺激小鼠C2C 12成肌細(xì)胞并分析炎癥小體的形成及活化、IL-1β的分泌。利用L-NAME和SNP處理IFN-γ誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞,分析NO是否影響肌細(xì)胞的炎性表征。我們的主要研究?jī)?nèi)容包括：第一章Notexin誘導(dǎo)的急性肌損傷及損傷肌組織NO水平檢測(cè)[目的]Notexin肌內(nèi)注射誘導(dǎo)急性骨骼肌損傷,分析損傷肌組織的潰變、炎性滲出、再生特性；檢測(cè)并對(duì)比分析NO的拮抗劑(L-NAME)/供體(SNP)處理前、后損傷肌組織內(nèi)NO濃度、NOS水平改變。[方法]清潔級(jí)雌性C57BL/6小鼠(4-8w)常規(guī)飼養(yǎng),脛骨前肌(tibialis anterrior, TA)注射notexin (O.lmg/kg),分別于Od,4d,7d,10d摘取小鼠TA,冰凍切片,HE及Dystrophin免疫熒光染色。分別于Notexin注射后第1、第4天腹腔注射L-NAME (100mg/kg)和SNP(0.5mg/kg),分別于notexin注射后第4天和第7天摘取TA,提取總RNA, Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA,經(jīng)特定引物(eNOS,iNOS, nNOS) PCR擴(kuò)增；組織勻漿后測(cè)定NO濃度。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[結(jié)果]HE及Dystrophin熒光染色表明,notexin注射4天時(shí),可見(jiàn)大量的肌纖維壞死及炎性滲出,7天時(shí)壞死區(qū)被擁有中央核的再生肌纖維替代。10天時(shí)肌纖維的再生基本完成。Notexin注射后4天,小鼠肌組織中NO濃度較對(duì)照組顯著上調(diào)(P0.05,n=3)；SNP處理后肌組織NO濃度較之單獨(dú)損傷組進(jìn)一步升高(P0.05,n=3)；反之,L-NAME處理會(huì)下調(diào)肌內(nèi)NO水平。qPCR結(jié)果表明,L-NAME能誘導(dǎo)損傷的TA肌內(nèi)eNOS, iNOS, nNOS基因表達(dá)下調(diào)(與單純的損傷組比較,P0.05,n=3),尤以iNOS下調(diào)最為顯著。SNP處理不影響NOS基因表達(dá)。[結(jié)論]Notexin肌內(nèi)注射能誘發(fā)骨骼肌的壞死及炎性滲出。由于notexin誘發(fā)的骨骼肌壞死于傷后4天最為廣泛,7天后再生的肌纖維完全替代潰變組織,因此我們分別選取4天和7天作為壞死、再生的取材時(shí)間點(diǎn)。急性肌損傷后,NOS以及肌源性NO濃度快速上調(diào)。SNP能進(jìn)一步上調(diào)損傷肌組織NO濃度,L-NAME則下調(diào)肌內(nèi)NO濃度。L-NAME能抑制肌內(nèi)NOS基因的表達(dá),尤其抑制iNOS基因水平。第二章NO對(duì)損傷骨骼肌炎癥反應(yīng)的干擾效應(yīng)[目的]體內(nèi)干擾NO水平(NO供體SNP,或拮抗劑L-NAME腹腔注射)。分析損傷TA肌組織內(nèi)自身抗原(Mi-2、HARS、DNA-PKcs、Ku-70)、TLRs(TLR3和TLR7)表達(dá)改變,肌內(nèi)淋巴細(xì)胞的滲出特性及凋亡改變,肌內(nèi)細(xì)胞因子(TNF-α、TGF-β、 IL-6和IL-10)和趨化因子(MIP-1α、MCP-1、MCP-3)的水平改變。通過(guò)上述研究,明確體內(nèi)NO濃度改變是否影響急性損傷的骨骼肌組織炎性反應(yīng)。[方法]TA肌內(nèi)注射notexin (0.1mg/kg),肌損傷后第2天腹腔注射L-NAME(100 mg/kg)或SNP (0.5 mg/kg),7天取材的動(dòng)物于損傷后第4天再次腹腔注射L-NAME或SNP。分別于損傷后第4天、7天摘取小鼠TA肌,提取肌組織總RNA, Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA,引物PCR擴(kuò)增檢測(cè)自身抗原、TLRs、細(xì)胞因子(TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-10)和趨化因子(MIP-1α、MCP-1、MCP-3);提取TA肌總蛋白,SDS/PAGE電泳分離轉(zhuǎn)膜,ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)自身抗原、TLRs的蛋白表達(dá)；TA肌冰凍切片,免疫熒光檢測(cè)肌內(nèi)滲出的CD11bs、F4/80、 CD3/CD8、MHC-Ⅰ (H-2Kb)、caspase-3日性細(xì)胞。組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[結(jié)果]Notexin注射4天時(shí),TA肌內(nèi)自身抗原(Mi-2、HRS和Ku-70)和TLR3的mRNA及蛋白水平顯著上調(diào)。L-NAME處理進(jìn)一步上調(diào)自身抗原和TLR3的表達(dá)水平,但SNP處理則下調(diào)上述分子水平。HE染色及免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn),損傷4天時(shí),肌纖維廣泛壞死崩解,可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞滲出,滲出細(xì)胞多為單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(CD11b+、F4/80+)。7天時(shí),仍可見(jiàn)少量滲出的單核/巨噬細(xì)胞,Dystrophine陽(yáng)性的再生肌纖維大量出現(xiàn)。熒光圖像定量分析表明,肌損傷4天時(shí)CDllb,或F4/80的平均熒光強(qiáng)度顯著增高,7天時(shí)下降,但仍高于正常肌組織。L-NAME處理組4天和7天時(shí)CD11b或F4/80的平均熒光強(qiáng)度均顯著高于單純損傷組,SNP處理則降低炎性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值。對(duì)CD11b+caspase-3+細(xì)胞的觀察和計(jì)數(shù)均支持SNP處理促進(jìn)單核細(xì)胞凋亡。qPCR結(jié)果表明,Notexin注射誘導(dǎo)損傷肌內(nèi)TGF-p(4d和7d)和IL-10(4d)mRNA水平升高,但L-NAME和SNP不影響上述分子表達(dá)。4d和7d時(shí)均可見(jiàn),SNP顯著下調(diào)TNF-α和IL-6、MIP-1α, MCP-1,和MCP-3 mRNA水平,L-NAME的作用相反,上調(diào)TNF-α、 IL-6、MIP-1α, MCP-1,和MCP-3 mRNA水平。肌損傷4天時(shí),我們未觀察到CD3ε+CD8a+細(xì)胞,以及H-2K b+肌纖維。7d時(shí),肌間隙內(nèi)可見(jiàn)少量CD8α+T細(xì)胞和H-2K b+肌纖維。我們發(fā)現(xiàn),L-NAME處理后,CD8α+T細(xì)胞和H-2Kb+肌纖維的數(shù)量顯著增加。[結(jié)論]骨骼肌損傷后上調(diào)的肌源性NO干擾肌內(nèi)炎癥反應(yīng),抑制骨骼肌自身抗原(Mi-2、HRS、Ku-70)和TLR3的表達(dá),減少單核/巨噬細(xì)胞滲出,促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡。同時(shí),NO參與下調(diào)肌內(nèi)的促炎因子和趨化因子,并可能抑制損傷肌組織內(nèi)再生肌纖維MHC-Ⅰ分子的表達(dá)及CD8α+T細(xì)胞的滲出。上述結(jié)果表明,NO參與下調(diào)骨骼肌損傷性炎癥反應(yīng)。第三章NO對(duì)體外炎性培養(yǎng)的成肌細(xì)胞/分化肌管免疫特性的干擾作用[目的]分析炎性環(huán)境(DFN-γ刺激)能否誘導(dǎo)C2C12成肌細(xì)胞/分化肌管表達(dá)MHC分子及活化的NLRP3炎癥小體、明確NO是否干擾C2C12細(xì)胞內(nèi)炎癥小體的活化。[方法]復(fù)蘇凍存的C2C12細(xì)胞,37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中以1×105/mL密度接種于6孔板貼壁增殖培養(yǎng),或采用2%馬血清分化培養(yǎng)。分別添加IFN-γ (0.6ug/ml)至增殖、或分化培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞。采用L-NAME(2.7ug/ml)及SNP(8.94ug/ml)處理IFN-γ干擾48h的分化細(xì)胞。分別于IFN-γ刺激后24h、48h,或L-NAME及SNP處理分化細(xì)胞6h后收集細(xì)胞、提取總RNA及總蛋白,qPCR和Western blot檢測(cè)MHC-Ⅰ(H-2Kb)、MHC-Ⅱ、ASC, NLRP3, caspase-1。ELISA技術(shù)檢測(cè)上述C2C12細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-1β蛋白濃度。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[結(jié)果]IFN-γ刺激培養(yǎng)后,增殖的成肌細(xì)胞和分化肌管均顯著上調(diào)MHC-Ⅰ mRNA及蛋白水平,并表達(dá)MHC-Ⅱ。qPCR、免疫熒光、免疫印跡檢測(cè)均證實(shí),IFN-γ誘導(dǎo)成肌細(xì)胞/分化肌管上調(diào)NLRP3、ASC和mature-caspase-1表達(dá)水平。ELISA分析進(jìn)一步證實(shí),較之未刺激的細(xì)胞,IFN-γ誘導(dǎo)會(huì)顯著上調(diào)C2C12細(xì)胞培養(yǎng)基中的IL-1β濃度。SNP處理后6h,分化肌管(IFN-γ刺激48h)內(nèi)炎癥小體(ASC, NLRP3, caspase-1) mRNA和蛋白水平較單純刺激細(xì)胞顯著下調(diào),L-NAME則上調(diào)ASC, NLRP3, caspase-1表達(dá)水平。與上述結(jié)果一致,SNP和L-NAME處理同時(shí)下調(diào)、或上調(diào)培養(yǎng)基中IL-1β濃度。[結(jié)論]炎性刺激可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞/再生肌纖維(肌管)成為兼職的APC細(xì)胞,并表達(dá)MHC分子。表達(dá)MHC分子的成肌細(xì)胞/分化肌管具備合成并活化NLRP3炎癥小體的能力。NO可能是肌細(xì)胞免疫特性的干擾因素之一
【關(guān)鍵詞】：一氧化氮 肌損傷 炎癥 C2C12細(xì)胞 炎癥小體
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R685
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-26
• 參考文獻(xiàn)22-26
• 第一章 Notexin誘導(dǎo)急性肌損傷及損傷肌組織NO水平檢測(cè)26-38
• 1 材料和方法26-31
• 2 結(jié)果31-35
• 3 討論35-36
• 4 結(jié)論36
• 5 參考文獻(xiàn)36-38
• 第二章 NO對(duì)損傷骨骼肌炎癥反應(yīng)的干擾效應(yīng)38-70
• 1 材料和方法38-49
• 2 結(jié)果49-65
• 3 討論65-67
• 4 結(jié)論67
• 5 參考文獻(xiàn)67-70
• 第三章 NO對(duì)體外炎性培養(yǎng)成肌細(xì)胞/分化肌管免疫特性的干擾作用70-105
• 1 材料與方法70-82
• 2 結(jié)果82-102
• 3 討論102-103
• 4 結(jié)論103
• 5 參考文獻(xiàn)103-105
• 全文小結(jié)105-106
• 綜述106-114
• 參考文獻(xiàn)110-114
• 中英文對(duì)照縮略詞表114-116
• 成果116-117
• 致謝117-120
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)合格證明120

  本文關(guān)鍵詞：一氧化氮（NO）對(duì)肌損傷炎癥反應(yīng)的干擾效應(yīng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：354780