本文關(guān)鍵詞：AngⅡ?qū)谒睾铣傻淖饔眉捌錂C制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：皮膚創(chuàng)傷后(燒傷、外傷、有創(chuàng)激光治療等)色素異常在臨床中十分常見,嚴(yán)重影響著患者的生活和心理,也越來越多的受到社會的關(guān)注。然而,目前治療創(chuàng)傷后瘢痕性色素異常的療效并不樂觀,也缺乏防止傷口愈合中這種并發(fā)癥出現(xiàn)的有效策略,對于臨床醫(yī)生而言面臨著巨大挑戰(zhàn)。近年來,盡管很多學(xué)者在創(chuàng)傷愈合及色素細(xì)胞方面進(jìn)行了廣泛研究,但仍未闡明其確切機制及確定良好的治療措施。創(chuàng)傷后色素異常的產(chǎn)生是十分復(fù)雜的過程,一般認(rèn)為可能與創(chuàng)傷后皮膚血運變化、局部炎癥刺激、理化因素導(dǎo)致局部代謝功能紊亂、黑素細(xì)胞功能受損或喪失等因素有關(guān)。皮膚色素產(chǎn)生及黑素合成受到多基因、多轉(zhuǎn)錄因子共同參與調(diào)控,而影響黑素生物合成的因素還包括很多,如黑素細(xì)胞周圍環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)改變、體內(nèi)的細(xì)胞因子、多種激素等等。然而,黑素合成過程中的關(guān)鍵調(diào)控因素是酪氨酸酶基因家族,酪氨酸酶是黑素合成中的限速酶,也可以說是調(diào)節(jié)黑素合成的開關(guān),起著至關(guān)重要的作用,其主要通過對酪氨酸起催化作用,繼而使多巴胺發(fā)生羥化反應(yīng),多巴醌發(fā)生氧化反應(yīng),進(jìn)而對黑素生成進(jìn)行調(diào)控。有研究證實,酪氨酸酶基因家族蛋白是黑素細(xì)胞特異性蛋白,主要受小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)的調(diào)節(jié)。MITF通過與酪氨酸酶家族啟動子中的特殊部位結(jié)合后,一方面可指導(dǎo)TRY和TRP-1在黑素細(xì)胞中特異性表達(dá),另一方面可刺激啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而對黑素細(xì)胞黑素生成進(jìn)行調(diào)控。因而,MITF在黑素合成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。多年來,在黑素細(xì)胞生物學(xué)作用的研究中,黑素生成的信號通路在黑素細(xì)胞的研究中也一直受到廣泛的關(guān)注,有研究發(fā)現(xiàn),在黑素合成過程中,兩條重要的信號通路發(fā)揮著非常重要作用,分別是蛋白激酶A(PKA)途徑和蛋白激酶C(PKC)途徑,而還有其他許多信號通路也存在并參與著黑素的合成,他們之間并不是孤立存在的,而是有著密切關(guān)聯(lián)性的。在黑素細(xì)胞的研究中,已證實,MITF可通過調(diào)控c AMP增高,促使PKC-β的表達(dá),繼而使PKC與c AMP途徑共同結(jié)合達(dá)到協(xié)同效應(yīng)。這種信號途徑之間的網(wǎng)絡(luò)狀信號交聯(lián)可擴大黑素生成作用的效應(yīng)。皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一個復(fù)雜而多步驟的過程,也是導(dǎo)致皮膚色素改變的重要誘因之一,修復(fù)過程可涉及到炎癥細(xì)胞的浸潤,細(xì)胞的增殖遷移等多個環(huán)節(jié)。研究表明在損傷修復(fù)過程中,Ang II幾乎涉及到了創(chuàng)傷愈合中的每個步驟。多項研究證明Ang II在局部皮膚組織中可促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的分裂、增殖從而加速皮膚創(chuàng)面愈合,也可通過增加血管通透性和炎癥細(xì)胞的趨化作用,進(jìn)而促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合。Ang II可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖,可通過刺激成纖維細(xì)胞而合成細(xì)胞外基質(zhì)成分,可通過AT1受體促進(jìn)膠原合成,還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖等等,均證明Ang II在創(chuàng)傷愈合中的重要作用。以往研究表明,在黑素瘤細(xì)胞和痣細(xì)胞上都被證實有Ang II受體的表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Ang II AT1受體的抑制限制了鼠黑素瘤的生長,并已有學(xué)者研究在分離的人黑素細(xì)胞中AT1受體和AT2受體m RNA水平表達(dá)情況,結(jié)果證明在培養(yǎng)的原始黑素細(xì)胞中,存在Ang II AT1受體的表達(dá),而并沒有AT2受體的表達(dá)。雖然許多研究表明Ang II在損傷修復(fù)中的各種功能,但AngⅡ是否在傷口愈合過程中可調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞系統(tǒng)而影響皮膚的色素變化尚是未知的研究領(lǐng)域。因此我們提出了問題并探索Ang II在人類黑色素細(xì)胞中的作用。本課題將以Ang II為研究目標(biāo),從研究其對黑素細(xì)胞中黑素細(xì)胞增殖和黑素合成著手,繼而對Ang II對黑素細(xì)胞中AT1受體的表達(dá)調(diào)節(jié)作用進(jìn)行分析,然后從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑方面對Ang II促黑素合成作用進(jìn)行深入研究。通過這一原創(chuàng)性研究,我們可望初步探討Ang II對人黑素細(xì)胞黑素合成的影響,加深理解Ang II調(diào)控黑素合成的分子和細(xì)胞機制,以期為進(jìn)一步了解創(chuàng)傷修復(fù)后色素異常的機制而尋求新的治療靶點及途徑。本課題研究內(nèi)容主要包括三部分:第一部分Ang II對人黑素細(xì)胞黑素合成及遷移的影響方法:根據(jù)預(yù)實驗選擇100 n M、10 n M、1 n M、0.1 n M、0.01 n M濃度的Ang II分別作用于黑素細(xì)胞24小時后,用噻唑藍(lán)比色法(MTT比色法)測定細(xì)胞的活性。通過Na OH溶解法、酪氨酸酶活性分析測定黑素含量和酪氨酸酶活性。通過細(xì)胞膜濾過遷移實驗,檢測Ang II對黑素細(xì)胞遷移活性的影響。結(jié)果:與空白組比較,Ang II對細(xì)胞增殖無明顯影響(P0.05)。Ang II作用于黑素細(xì)胞24小時后,與空白對照組比較,在0.1~100 n M Ang II范圍內(nèi)酪氨酸酶活性呈劑量依賴方式明顯遞增,在10~100 n M范圍內(nèi)對黑素合成有明顯促進(jìn)作用(P0.05),而在100 n M Ang II濃度時的作用均達(dá)到最強(P0.01)。而0.01 n M濃度的Ang II,對酪氨酸酶活性沒有影響;在0.01~1 n M范圍內(nèi)Ang II對黑素合成無顯著作用(P0.05)。細(xì)胞遷移實驗則顯示100 n M Ang II較空白對照組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P0.05)。結(jié)論:Ang II對黑素細(xì)胞增殖無明顯影響,可能與本實驗中孵育濃度及時間有限有關(guān);Ang II可促進(jìn)黑素細(xì)胞黑素的合成及促進(jìn)黑素細(xì)胞的遷移。第二部分Ang II對人黑素細(xì)胞中AT1受體及酪氨酸酶活性和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)方法:用100 n M、10 n M、1 n M、0.1 n M、0.01 n M濃度的Ang II分別作用于黑素細(xì)胞24小時后,應(yīng)用半定量RT-PCR和Western blot的方法,檢測不同濃度下AT1受體及酪氨酸酶m RNA轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白的表達(dá)。同時,根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,選取AT 1受體拮抗劑1000 n M LOS干預(yù)黑素細(xì)胞后,檢測AT1受體及酪氨酸酶的m RNA轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白的表達(dá)變化情況,以及對黑素細(xì)胞遷移的影響情況。結(jié)果:在0.1~100 n M濃度范圍內(nèi),Ang II對人黑素細(xì)胞中AT1受體及酪氨酸酶的m RNA和蛋白水平都有不同程度的上調(diào)作用;而這些作用,均可被Ang II AT1受體拮抗劑LOS所抑制。通過細(xì)胞膜濾過遷移實驗結(jié)果顯示,LOS并不能抑制Ang II對黑素細(xì)胞的促遷移效應(yīng)。結(jié)論:AT1受體可介導(dǎo)Ang II誘導(dǎo)黑素細(xì)胞中酪氨酸酶的增加,其可能與酪氨酸酶信號密切相關(guān);Ang II可經(jīng)AT1受體調(diào)節(jié)促進(jìn)黑素合成作用,但并不經(jīng)AT 1受體促進(jìn)黑素細(xì)胞的遷移效應(yīng)。第三部分MITF和PKC參與Ang II對人黑素細(xì)胞酪氨酸酶及黑素合成作用的調(diào)節(jié)方法:按實驗設(shè)計將不同濃度的Ang II與培養(yǎng)的黑素細(xì)胞處理后,用RT-PCR和Western blot方法對MITF m RNA和蛋白水平進(jìn)行檢測。而后選擇特異性的PKA抑制劑H89和特異性的PKC抑制劑Ro-32-0432處理黑素細(xì)胞1小時后,加入100 n M濃度的Ang II孵育黑素細(xì)胞24小時,對黑素合成含量進(jìn)行檢測。再據(jù)此結(jié)果,選取100n M的Ang II和PKC抑制劑Ro-32-0432共同作用于黑素細(xì)胞后通過RT-PCR和Western-blot方法檢測酪氨酸酶m RNA和蛋白水平表達(dá)的變化。用ELESIA方法檢測Ang II作用后黑素細(xì)胞中PKC活性的變化。結(jié)果:Ang II可上調(diào)黑素細(xì)胞內(nèi)MITF及酪氨酸酶的m RNA和蛋白水平。當(dāng)選擇性抑制PKC途徑時,可逆轉(zhuǎn)Ang II誘導(dǎo)黑素合成、上調(diào)酪氨酸酶m RNA及蛋白表達(dá)的作用,而PKA途徑受到抑制后,Ang II的這些作用并沒有受到抑制。用ELESIA的方法檢測出Ang II作用后黑素細(xì)胞中PKC活性明顯增加。結(jié)論:Ang II上調(diào)酪氨酸酶的表達(dá)促進(jìn)黑素合成的作用一方面可能與調(diào)節(jié)MITF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有關(guān),另一方面可能與激活PKC途徑有關(guān)。綜上所述,Ang II可促進(jìn)人黑素細(xì)胞的黑素合成,而其作用可能通過AT 1受體調(diào)節(jié)酪氨酸酶活性而發(fā)揮效應(yīng),而MITF、PKC也是參與Ang II促進(jìn)人黑素細(xì)胞黑素合成過程中的重要因素。值得注意的是本實驗結(jié)果首次對Ang II對黑素細(xì)胞功能的影響和調(diào)控做了初步研究,表明Ang II經(jīng)AT1受體調(diào)節(jié)酪氨酸酶的潛在作用,并支持在黑素細(xì)胞中Ang II、酪氨酸酶和AT1受體之間的關(guān)系,支持MITF和PKC參與Ang II對黑素細(xì)胞中黑素合成的作用。AT1受體在人黑素細(xì)胞中的功能鑒定為黑素細(xì)胞的生理作用提供了新的視角,而其調(diào)控機制及其他方面功能仍需進(jìn)一步深入研究,以評估AngⅡ在皮膚色素病理生理中的作用,進(jìn)而為創(chuàng)傷后色素沉著異常尋求新的治療靶點提供新的線索。
【關(guān)鍵詞】：Ang II 黑素細(xì)胞 AT1受體 酪氨酸酶 MITF PKC
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R751
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-19
• 第二章 Ang II對人黑素細(xì)胞黑素合成及細(xì)胞遷移的影響19-28
• 2.1 材料與方法19-23
• 2.2 實驗結(jié)果23-26
• 2.3 討論26-27
• 2.4 小結(jié)27-28
• 第三章 Ang II對人黑素細(xì)胞中AT1受體及酪氨酸酶活性和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)28-49
• 3.1 材料與方法28-41
• 3.2 實驗結(jié)果41-46
• 3.3 討論46-48
• 3.4 小結(jié)48-49
• 第四章 MITF和PKC參與Ang II對人黑素細(xì)胞酪氨酸酶及黑素合成的調(diào)節(jié)49-64
• 4.1 材料與方法49-57
• 4.2 實驗結(jié)果57-60
• 4.3 討論60-63
• 4.4 小結(jié)63-64
• 全文總結(jié)64-65
• 參考文獻(xiàn)65-72
• 文獻(xiàn)綜述 Ang II在皮膚創(chuàng)傷愈合中的作用72-92
• 參考文獻(xiàn)84-92
• 攻讀博士學(xué)位期間的研究成果92-93
• 致謝93

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：AngⅡ?qū)谒睾铣傻淖饔眉捌錂C制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：353491