本文關(guān)鍵詞：DNA電化學(xué)生物傳感器檢測肺癌患者表皮生長因子受體基因突變狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：表皮生長因子受體(EGFR)是細(xì)胞通路中傳遞細(xì)胞信號(hào)的一種重要物質(zhì)。EGFR基因突變狀態(tài)是靶向藥物小分子酪氨酸激酶抑制劑用于非小細(xì)胞肺癌的治療療效的重要預(yù)測指標(biāo),國內(nèi)外各權(quán)威指南均推薦需對(duì)EGFR突變狀態(tài)進(jìn)行檢測,但目前無標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。DNA電化學(xué)傳感器具有靈敏度高,特異性好,而且簡便、經(jīng)濟(jì)、易行等特點(diǎn)而備受關(guān)注。本課題組在應(yīng)用電化學(xué)傳感器檢測基因方面具有一定的研究基礎(chǔ),前期實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建“基于蛋白質(zhì)控制組裝界面的安培型DNA電化學(xué)傳感器”,具有良好的重現(xiàn)性和靈敏度。本研究應(yīng)用前期構(gòu)建的安培型電化學(xué)傳感器,采用三明治結(jié)構(gòu)的i-t法,檢測肺癌患者EGFR基因突變狀態(tài),并對(duì)其外顯子19的6種熱點(diǎn)缺失類型(del1-del6)進(jìn)行區(qū)分。通過利用DNA雜交特點(diǎn)設(shè)計(jì)不同堿基序列,提高特異性,采用引入核酸酶形成雜交酶切循環(huán)和免疫學(xué)中的鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)等方法提高靈敏度,建立非小細(xì)胞肺癌患者EGFR檢測新技術(shù),實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床肺癌組織實(shí)際樣品PCR產(chǎn)物的檢測,本研究最終為DNA電化學(xué)傳感器檢測疾病診治相關(guān)基因并廣泛應(yīng)用于臨床奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本文主要研究工作如下:(1)在第一部分中,為了提高DNA電化學(xué)傳感器的檢測特異性,我們利用DNA在不同相系中雜交效率不同的特點(diǎn),設(shè)計(jì)3種不同序列的DNA:C、R、C/R。3種DNA之間的主要區(qū)別是缺失序列在目標(biāo)鏈中分布的位置不同,從而使得非互補(bǔ)序列之間的雜交分別發(fā)生在電極表面、雜交液中以及電極表面和雜交液中各一半。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明應(yīng)用C型DNA(非互補(bǔ)雜交發(fā)生在電極表面的DNA序列),具有最佳的雜交特異性,并用其構(gòu)建具有高特異性的DNA電化學(xué)傳感器。同時(shí),我們對(duì)人工合成雙鏈樣品的測定進(jìn)行研究,比較了高溫變性和λ-exo消化兩種制備單鏈DNA的方法對(duì)電化學(xué)檢測的影響。結(jié)果表明,λ-exo消化產(chǎn)物可得到接近人工合成單鏈的電流值,且無復(fù)性等弊端,與三明治檢測系統(tǒng)不存在相互作用,可作為獲得單鏈的方法與dna電化學(xué)傳感器三明治檢測系統(tǒng)聯(lián)用。隨后,應(yīng)用所構(gòu)建的dna電化學(xué)傳感器對(duì)臨床肺癌組織的pcr產(chǎn)物進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)6種不同的引物并優(yōu)選pcr結(jié)果最好的引物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過λ-exo對(duì)pcr產(chǎn)物的處理,成功獲得目標(biāo)ssdna,應(yīng)用dna電化學(xué)傳感器采用i-t法檢測,根據(jù)所得電流信號(hào)可區(qū)分野生型與缺失型egfr。(2)在第一部分的基礎(chǔ)上,第二部分對(duì)egfr外顯子19的6種常見缺失類型進(jìn)行區(qū)分。第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),非互補(bǔ)序列之間的雜交發(fā)生在接近電極表面的傳感器特異性更高,本部分為達(dá)到各種缺失類型間的最大區(qū)分度,通過設(shè)計(jì)不同探針,對(duì)dna探針中非互補(bǔ)序列的位置進(jìn)行優(yōu)化,研究在電極表面的非均相雜交環(huán)境中,非互補(bǔ)雜交發(fā)生在捕獲探針上的不同位置對(duì)雜交特異性的影響,結(jié)果顯示非互補(bǔ)序列分布在捕獲探針中段時(shí),單堿基錯(cuò)配的del1和del2之間可顯示最佳區(qū)分度,此時(shí)雜交特異性最好�；诖私Y(jié)果,結(jié)合egfr常見的6種突變類型進(jìn)行捕獲探針設(shè)計(jì),并根據(jù)檢測電流結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)分組,簡化工作量,實(shí)現(xiàn)了快速區(qū)分egfr基因外顯子19的突變類型。同時(shí)運(yùn)用以上的方法對(duì)實(shí)際樣品的pcr產(chǎn)物進(jìn)行檢測,所得結(jié)果與測序結(jié)果相符,證明了本檢測方法的準(zhǔn)確性,成功用于實(shí)際樣品區(qū)分egfr外顯子19的6種熱點(diǎn)缺失類型。(3)第三部分將前兩部分應(yīng)用的“基于蛋白質(zhì)控制組裝界面的安培型dna電化學(xué)傳感器”與核酸外切酶輔助形成的雜交-酶切循環(huán)信號(hào)放大系統(tǒng)相結(jié)合,構(gòu)建一種在液相的均相介質(zhì)中進(jìn)行酶切的具有放大效應(yīng)的復(fù)合體系。通過目標(biāo)鏈與輔助鏈雜交形成雙鏈,觸發(fā)核苷酸酶對(duì)雙鏈中的輔助鏈的識(shí)別及剪切作用,形成雜交-酶切循環(huán),使少量目標(biāo)鏈通過多次重復(fù)利用而達(dá)到放大檢測信號(hào)的目的。為了選擇最適外切酶,對(duì)exo-iii和λ-exo進(jìn)行比較,根據(jù)結(jié)果選擇λ-exo參與反應(yīng),同時(shí)對(duì)雜交酶切的反應(yīng)時(shí)間,酶切濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。并進(jìn)一步考察了生物素在雙鏈中的位置對(duì)檢測信號(hào)的影響,發(fā)現(xiàn)縮短生物素與電極表面距離,可增加檢測響應(yīng)電流信號(hào),并依此優(yōu)選生物素在三明治構(gòu)型傳感器中的位置。本部分所構(gòu)建的傳感器較之單獨(dú)bsa控制組裝的體系,可顯著降低檢測限至0.01nm,線性范圍是2.0×10-11-4.0×10-10m,并具有良好的特異性,可區(qū)分野生型與缺失型egfr。(4)第四部分在第三部分的基礎(chǔ)上,將酶切對(duì)象改變?yōu)樾盘?hào)探針,使信號(hào)探針具有可被酶切及信號(hào)報(bào)告的雙重作用,簡化雜交酶切循環(huán)體系,減少參與反應(yīng)的DNA的種類數(shù),使檢測對(duì)象能夠更直接地反映目標(biāo)序列的存在情況。同時(shí),為了擴(kuò)大信號(hào)探針的響應(yīng)信號(hào),提高靈敏度,我們引入了免疫學(xué)中SABC法,通過鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化酶(SA-H)與生物素標(biāo)記的辣根過氧化酶(B-H)形成復(fù)合物,并將復(fù)合物與電極表面的生物素結(jié)合,可增加辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合到電極表面上的量,提高電流信號(hào)。通過兩種信號(hào)放大方法,可顯著提高靈敏度,檢測限達(dá)到1 pM,線性范圍2.0×10-12-3.0×10-11M。將本方法用于實(shí)際樣品PCR產(chǎn)物的檢測,檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致,本方法可有效區(qū)分臨床實(shí)際樣品中的野生型與缺失型EGFR。
【關(guān)鍵詞】：DNA電化學(xué)傳感器 時(shí)間電流曲線法 表皮生長因子受體 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) λ核酸外切酶 雜交-酶切循環(huán) 鏈霉親和素生物素復(fù)合物法
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 英文縮寫詞表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-32
• 1. EGFR 突變概述14-15
• 2. EGFR 基因突變檢測的臨床意義15
• 3. 常用EGFR基因突變檢測方法15-16
• 4. DNA 電化學(xué)生物傳感器檢測方法16-17
• 5. 提高 DNA 電化學(xué)生物傳感器特異性17-18
• 6. 提高 DNA 電化學(xué)生物傳感器靈敏度18-20
• 7. 應(yīng)用電化學(xué)傳感器檢測臨床實(shí)際樣品20-23
• 參考文獻(xiàn)23-32
• 第一部分 基于DNA雜交相系特點(diǎn)設(shè)計(jì)EGFR基因電化學(xué)傳感器32-60
• 1.1 儀器與試劑35-39
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法39-45
• 1.3 結(jié)果和討論45-50
• 1.4 實(shí)際樣品的檢測50-53
• 1.5 小結(jié)53-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 第二部分DNA探針中非互補(bǔ)序列的位置優(yōu)化60-86
• 2.1 儀器與試劑62-66
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法66-70
• 2.3 結(jié)果與討論70-78
• 2.4 實(shí)際樣品的檢測78-82
• 2.5 小結(jié)82-83
• 參考文獻(xiàn)83-86
• 第三部分 核酸外切酶輔助目標(biāo)鏈循環(huán)信號(hào)放大86-108
• 3.1 儀器與試劑89-91
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法91-94
• 3.3 結(jié)果與討論94-104
• 3.4 小結(jié)104-105
• 參考文獻(xiàn)105-108
• 第四部分 酶輔助循環(huán)與生物素-鏈霉親和素酶復(fù)合物雙重信號(hào)放大108-132
• 4.1 儀器與試劑111-114
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法114-117
• 4.3 結(jié)果與討論117-127
• 4.4 實(shí)際樣品的檢測127-129
• 4.5 小結(jié)129-130
• 參考文獻(xiàn)130-132
• 結(jié)論132-134
• 致謝134-135
• 綜述135-149
• 參考文獻(xiàn)146-149

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 MA Wen li;DNA Diagnosis and Gene Therapy:Advances and Prospects in the 21st Century[J];深圳大學(xué)學(xué)報(bào);2000年04期

2 葛學(xué)銘,陸應(yīng)麟,付生法,范文紅,劉爽;A NOVEL HUMAN DNA SEQUENCE WITH TUMOR METASTASIS SUPPRESSIVE ACTIVITY[J];Chinese Journal of Cancer Research;2000年02期

3 曹暉,劉玉萍,小松かつ子,畢培曦,邵鵬柱;DNA Molecular Profiling:A New Approach to Quality Control of Chinese Drugs[J];Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine;2000年01期

4 ;DNA REPAIR CAPACITY IN LUNG CANCER PATIENTS[J];癌變.畸變.突變;2001年04期

5 黃力拉,朱剛勁;被拐賣及失蹤兒童采血驗(yàn)DNA前的心理問題及對(duì)策[J];齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年03期

6 安小惠 ,王一理 ,來寶長 ,耿一萍 ,司履生;CONSTRUCTION OF HUMAN INTERLUEKIN-18 DNA VACCINE AND IT'S EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS[J];Journal of Xi'an Medical University;2001年02期

7 ;A Study of PCR with DNA Extracted from Single Cell Isolated from Histological Sections[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年01期

8 王軍陽,范桂香,勝利,袁育康;THE CONSTRUCTION AND PRELIMINARY APPRAISEMENT OF HSV-2 gD GENE DNA VACCINE[J];Academic Journal of Xi'an Jiaotong University;2002年02期

9 董菁 ,成軍 ,王勤環(huán) ,施雙雙 ,王剛 ,斯崇文;CLONING AND ANALYSIS OF THE GENOMIC DNA SEQUENCE OF AUGMENTER OF LIVERR EGENERATION FROM RAT[J];Chinese Medical Sciences Journal;2002年02期

10 ;Real time observation of the photocleavage of single DNA molecules[J];Chinese Science Bulletin;2003年07期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 Michael J.Siefkes;Cory O.Brant;Ronald B.Walter;;A novel real-time XL-PCR for DNA damage detection[A];漁業(yè)科技創(chuàng)新與發(fā)展方式轉(zhuǎn)變——2011年中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2011年

2 ;Hormonal Regulation and Tumorigenic Role of DNA Methyltransferase[A];2011中國婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議暨浙江省計(jì)劃生育與生殖醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨生殖健康講習(xí)班論文匯編[C];2011年

3 Dongmei Zhao;Fan Jin;Yuli Qian;Hefeng Huang;;Expression patterns of Dnmtl and Dnmt3b in preimplantational mouse embryos and effects of in-vitro cultures on their expression[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議婦科內(nèi)分泌會(huì)場（婦科內(nèi)分泌學(xué)組、絕經(jīng)學(xué)組、計(jì)劃生育學(xué)組）論文匯編[C];2012年

4 姜東成;蔣稼歡;楊力;蔡紹皙;K.-L.Paul Sung;;在聚吡咯微點(diǎn)致動(dòng)下的DNA雜交行為[A];2008年全國生物流變學(xué)與生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2008年

5 白明慧;翁小成;周翔;;聯(lián)鄰苯二酚類小分子作為DNA交聯(lián)劑的研究[A];第六屆全國化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

6 張曄;杜智;楊斌;高英堂;;檢測外周血中游離DNA的應(yīng)用前景(綜述)[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第29屆學(xué)術(shù)年會(huì)暨首屆生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2009年

7 周紅;鄭江;王良喜;丁國富;魯永玲;潘文東;羅平;肖光夏;;CpG DNA誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合征的作用及其機(jī)制研究[A];全國燒傷創(chuàng)面處理、感染專題研討會(huì)論文匯編[C];2004年

8 ;EFFECTS OF Ku70-DEFICIENT ON ARSENITE-INDUCED DNA DOUBLE STRAND BREAKS, CHROMOSOMAL ALTERATIONS AND CELL CYCLE ARREST[A];海峽兩岸第三屆毒理學(xué)研討會(huì)論文摘要[C];2005年

9 李經(jīng)建;冀中華;蔡生民;;小溝結(jié)合方式中的DNA媒介電荷轉(zhuǎn)移[A];第十三次全國電化學(xué)會(huì)議論文摘要集（下集）[C];2005年

10 ;The interaction between Levofloxacine Hydrochloride and DNA mediated by Cu~(2+)[A];湖北省化學(xué)化工學(xué)會(huì)2006年年會(huì)暨循環(huán)經(jīng)濟(jì)專家論壇論文集[C];2006年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 本報(bào)記者 袁滿;平安：把“領(lǐng)先”作為DNA[N];經(jīng)濟(jì)觀察報(bào);2006年

2 舒放;編織一個(gè)DNA納米桶[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

3 閆潔;英兩無罪公民起訴要求銷毀DNA記錄[N];新華每日電訊;2008年

4 何德功;日本制成診斷魚病的“DNA書”[N];農(nóng)民日報(bào);2004年

5 本報(bào)記者 張巍巍;DNA樣本也能作假[N];科技日報(bào);2009年

6 周斌偉　鄒巍;蘇州警方應(yīng)用DNA技術(shù)一年偵破案件1887起[N];人民公安報(bào);2011年

7 本報(bào)記者 楊天笑;揭秘“神探”DNA[N];蘇州日報(bào);2011年

8 第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室教授 李福洋;破除法老DNA的咒語[N];東方早報(bào);2011年

9 常麗君;DNA電路可檢測導(dǎo)致疾病的基因損傷[N];科技日報(bào);2012年

10 常麗君;效率和質(zhì)量：“DNA制造業(yè)”兩大障礙被攻克[N];科技日報(bào);2012年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 唐陽;基于質(zhì)譜技術(shù)的基因組DNA甲基化及其氧化衍生物分析[D];武漢大學(xué);2014年

2 池晴佳;DNA動(dòng)力學(xué)與彈性性質(zhì)研究[D];重慶大學(xué);2015年

3 胡璐璐;哺乳動(dòng)物DNA去甲基化過程關(guān)鍵酶TET2的三維結(jié)構(gòu)與P暬蒲芯縖D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 馬寅洲;基于滾環(huán)擴(kuò)增的DNA自組裝技術(shù)的研究[D];南京大學(xué);2014年

5 黃學(xué)鋒;精子DNA碎片的臨床意義：臨床和實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

6 隋江東;APE1促進(jìn)DNA-PKcs介導(dǎo)hnRNPA1磷酸化及其在有絲分裂期端粒保護(hù)中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

7 劉松柏;結(jié)構(gòu)特異性核酸酶FEN1在DNA復(fù)制及細(xì)胞周期過程中的功能性研究[D];浙江大學(xué);2015年

8 王璐;哺乳動(dòng)物中親本DNA甲基化的重編程與繼承[D];中國科學(xué)院北京基因組研究所;2015年

9 齊文靖;染色質(zhì)改構(gòu)蛋白BRG1在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中的作用及機(jī)制研究[D];東北師范大學(xué);2015年

10 龍湍;水稻T-DNA插入突變?nèi)后w側(cè)翼序列的分離分析和OsaTRZ2的克隆與功能鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 董洪奎;面向可視化納米操作的DNA運(yùn)動(dòng)學(xué)建模及誤差實(shí)時(shí)校正方法[D];沈陽理工大學(xué);2014年

2 聞金燕;水溶性羧基和吡啶基咔咯大環(huán)與DNA和人血清蛋白的相互作用[D];華南理工大學(xué);2015年

3 江懌雨;水溶性羧酸卟啉及其配合物與DNA和人血清蛋白的相互作用[D];華南理工大學(xué);2015年

4 高志森;比較外周游離循環(huán)腫瘤DNA與癌胚抗原監(jiān)測非小細(xì)胞肺癌根治術(shù)前后腫瘤負(fù)荷變化的初步研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

5 丁浩;血漿循環(huán)DNA完整性及多基因甲基化對(duì)肺癌診斷價(jià)值的研究[D];河北大學(xué);2015年

6 王鵬;基于碳點(diǎn)@氧化石墨烯復(fù)合材料DNA生物傳感器的構(gòu)建及用于PML/RARα基因檢測[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

7 李海青;轉(zhuǎn)堿篷和鹽角草總DNA的耐鹽紫花苜蓿的選育[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

8 李婷婷;小鼠DNA模式識(shí)別重要受體的分子結(jié)構(gòu)特征及其功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

9 劉瑞斯;抗癌藥物奧沙利鉑與DNA相互作用的原子力顯微鏡觀察研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

10 熊忠;芳香二肽與一價(jià)金屬離子間相互作用及DNA切割活性的研究[D];鄭州大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：DNA電化學(xué)生物傳感器檢測肺癌患者表皮生長因子受體基因突變狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：347125