本文關(guān)鍵詞：抑制Evi1基因表達(dá)促進(jìn)BMSCs成骨分化治療骨質(zhì)疏松癥的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞、導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。隨人類壽命的延長和社會(huì)老年化的到來,骨質(zhì)疏松癥已成為人類重要的健康問題。目前對(duì)骨質(zhì)疏松的治療措施主要分為基礎(chǔ)措施和藥物治療兩個(gè)方面�；A(chǔ)治療措施中主要是補(bǔ)充鈣劑和維生素D。藥物治療主要包括抗骨吸收藥物、促骨形成藥物和其他藥物。但由于對(duì)骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制并不完全清楚,所以當(dāng)前對(duì)于骨質(zhì)疏松的治療并不理想。因此,進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松形成機(jī)制以及尋求更好的治療方法,降低骨折發(fā)病率和提高生活質(zhì)量是當(dāng)前骨質(zhì)疏松治療研究的重點(diǎn)。骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制有很多,目前也取得了很多進(jìn)展。近年來有越來越多的證據(jù)證明骨質(zhì)疏松與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的相對(duì)缺乏相關(guān);而且大量的研究發(fā)現(xiàn)患有骨質(zhì)疏松的絕經(jīng)期女性與正常女性相比不但常常伴有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化能力的降低,同時(shí)伴有骨髓組織中脂肪成分的增加。那么也就是說骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化能力的增加也可能是骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制。是不是抑制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化就能在一定程度上緩解骨質(zhì)疏松的進(jìn)程。要抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪分化,我們首先要明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的關(guān)健調(diào)控因素。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)異位病毒整合位點(diǎn)1(ectopic viral integration site,Evi1)是前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化為成熟脂肪細(xì)胞的決定因素;干擾該基因的表達(dá)則會(huì)阻斷3T3-L1細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的進(jìn)程。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分成為脂肪細(xì)胞,也可視為一種前脂肪細(xì)胞,異位病毒整合位點(diǎn)也應(yīng)該會(huì)決定其向脂肪細(xì)胞分化的過程�；谝陨�,提出三點(diǎn)假設(shè):在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂肪分化過程中存在Evi1基因的表達(dá);Evi1基因決定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂肪分化;抑制Evi1基因的表達(dá)可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面對(duì)以上問題展開了研究工作,研究內(nèi)容主要包括以下四個(gè)部分:1提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。2在干細(xì)胞成脂分化過程中研究Evi1基因的表達(dá)以及如何表達(dá)。3構(gòu)建腺病毒載體,采用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并測定其干擾效率和干擾作用。4制作大鼠骨質(zhì)疏松模型,通過尾靜脈注射腺病毒轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察對(duì)骨質(zhì)疏松的治療效果。第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定目的學(xué)習(xí)并掌握大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)技術(shù),并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞表面標(biāo)記物、成骨成脂誘導(dǎo)分化的鑒定。為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供研究基礎(chǔ)。方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性SPF級(jí)Sprague Dawley(SD)大鼠,體重100-120g,由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的原代分離培養(yǎng)5%水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠,無菌條件下快速取大鼠的股骨及脛骨,去除肌肉等軟組織,PBS清洗干凈。剪掉長骨的骨骺端,露出骨髓腔,用含有100U/ml青、鏈霉素和10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,直至骨質(zhì)發(fā)白;將沖出的骨髓內(nèi)容物分置于培養(yǎng)瓶中,每只動(dòng)物骨髓可接種兩個(gè)T25培養(yǎng)瓶,置于37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。3.BMSCs的培養(yǎng)、純化及傳代在原代培養(yǎng)過程中,24小時(shí)后更換全部培養(yǎng)基,以后每周更換兩次完全培養(yǎng)液,待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿約90%時(shí),使用胰酶-EDTA溶液消化,1:4/5的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。4.BMSCs的形態(tài)學(xué)檢查培養(yǎng)后使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化以及生長情況,并進(jìn)行拍照。5.流式細(xì)胞術(shù)測定的細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)取第3代生長狀態(tài)良好BMSCs,胰酶-EDTA溶液消化,1 000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘,倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞,依次在各管中加入單克隆抗體CD34,CD44,CD45和CD90 4℃條件下孵育30分鐘,用PBS液洗滌細(xì)胞3次,以除去未結(jié)合抗體,與FITC標(biāo)記和PE標(biāo)記的二抗避光作用30分鐘,再用PBS液重懸細(xì)胞并置于冰上,上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。6.BMSCs的成骨成脂誘導(dǎo)分化能力取第3代生長良好的BMSCs,接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待細(xì)胞貼壁生長至細(xì)胞密度達(dá)80-90%時(shí),在各誘導(dǎo)孔的完全培養(yǎng)液中分別加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑和成脂細(xì)胞誘導(dǎo)劑,各誘導(dǎo)孔每3-4天換液1次,同時(shí)設(shè)置L-DMEM完全培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)孔作為空白對(duì)照。成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)16天后,室溫下4%多聚甲醛固定10分鐘,對(duì)誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色;成骨誘導(dǎo)時(shí)細(xì)胞密度要求達(dá)到100%,成脂細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)21天后,4%多聚甲醛固定,對(duì)誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色。倒置顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果 1.BMSCs的形態(tài)學(xué)觀測SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)主要呈梭形細(xì)胞,細(xì)胞集落呈放射狀排列,細(xì)胞長勢良好,可穩(wěn)定傳代20代以上。2.BMSCs表面標(biāo)記物的表達(dá)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD44、CD90均呈陽性表達(dá),而CD34、CD45呈陰性表達(dá)。3.BMSCs成骨成脂誘導(dǎo)分化鑒定經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)分化后,分別用茜素紅染色和油紅O染色均呈陽性。結(jié)論全骨髓貼壁培養(yǎng)法操作步驟簡單,能夠大量分離、純化、擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,獲得的細(xì)胞具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性,經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后有成骨和成脂分化潛能。第二部分Evi1基因在骨髓干細(xì)胞成脂分化中的表達(dá)目的在體外通過成熟的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)其成脂分化,使用PCR和Western blotting方法檢測Evi1基因的表達(dá)。方法 1.細(xì)胞傳至第3代全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。2.引物設(shè)計(jì)與合成引物設(shè)計(jì)與合成由大連寶生物公司協(xié)助完成。3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成脂誘導(dǎo)分化細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿中48小時(shí),然后加入含200μM吲哚美辛,1μM地塞米松,0.5m M IBMX,和0.5μg/ml胰島素的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,每周更換兩次培養(yǎng)基。正常骨髓干細(xì)胞為對(duì)照組。4.Real-time PCR測定Evi1基因的表達(dá)在加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后連續(xù)10天中每日提取細(xì)胞總RNA,按照說明書將提取的RNA在一定的化學(xué)反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄條件下合成c DNA,加入到1μl c DNA與上游引物、下游引物、水及SYBR#174;Premix Ex Taq在CFX96?Real-Time PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,記錄Ct值、擴(kuò)增曲線以及溶解曲線。并相對(duì)定量計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果(2-ΔΔCT法)。5.Western blotting測定Evi1基因的蛋白含量在加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后連續(xù)10天中每日提取細(xì)胞總蛋白,用BCA法測定蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠,上樣(上樣量均為25μg/孔)、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、經(jīng)過一抗、二抗反反應(yīng)后,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光,利用Image J軟件進(jìn)行條帶分析。用目的蛋白的灰度值除去內(nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差,所得結(jié)果代表樣品的目的蛋白的相對(duì)含量。結(jié)果與正常培養(yǎng)的骨髓干細(xì)胞相比,Evi1基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化前五天存在一過性高表達(dá),并在第三天達(dá)到高峰。結(jié)論通過成熟的骨髓干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)方法成功誘導(dǎo)干細(xì)胞的成脂分化,并在這一過程中運(yùn)用Real-time PCR和Western blotting分別從Evi1基因m RNA和蛋白水平進(jìn)行檢測,驗(yàn)證了本本實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)假設(shè)。為下一步實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。第三部分腺病毒載體構(gòu)建以及Evi1基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分中的作用目的以腺病毒為載體,體外構(gòu)建Evi1基因的干擾質(zhì)粒,對(duì)骨髓干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染后對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨分化的影響。為基因治療骨質(zhì)疏松探索新的藥物靶點(diǎn)。方法 1.干擾序列的設(shè)計(jì)與合成大鼠Evi1的m RNA序列(Gene Accession No.:NM_001106423.1),分別針對(duì)第149和1423位點(diǎn)為起點(diǎn)人工合成2條si RNA序列,綠色熒光蛋白序列作為陰性對(duì)照。2.重組腺病毒的構(gòu)建與包裝選擇限制性內(nèi)切酶(Bg L2和Hind III)將上述目的片斷定向克隆入穿梭載體p Ad-Track-U6;挑取較小的克隆,接種到含卡那霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基中,250轉(zhuǎn)/分鐘,37℃培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒;提取的穿梭質(zhì)粒用Pme I對(duì)陽性質(zhì)粒進(jìn)行線性化,通常酶切過夜;電轉(zhuǎn)化重組,取線性化的穿梭載體與腺病毒骨架載體充分混合,然后加入到電轉(zhuǎn)杯中,放入電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化;挑取較小的單克隆,10到15個(gè),接種到含卡那霉素的5ml液體LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過夜;提取質(zhì)粒,選取3到4個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行酶切,用Pac I進(jìn)行酶切,然后電泳檢測篩選陽性質(zhì)粒;將鑒定正確的質(zhì)粒按照Lipofectmine2000轉(zhuǎn)染試劑要求,轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,收集細(xì)胞及培養(yǎng)液反復(fù)凍融后2000g離心收集上清;再次感染293A細(xì)胞,重復(fù)這一過程以增加病毒滴度;濃縮、純化重組腺病毒;透析純化病毒懸液;測定重組腺病毒的滴度。3.轉(zhuǎn)染BMSCs取生長良好的傳至第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿中等細(xì)胞生長至80%融合時(shí),更換無血清L-DMEM培養(yǎng)基后12小時(shí)加入適量的病毒,6-8小時(shí)后更換為骨髓間充干質(zhì)細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基,24小時(shí)后在倒置熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光。4.通過Real-time PCR測定干擾效率在成功轉(zhuǎn)染后3天提取RNA,同時(shí)提取正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的RNA作為對(duì)照組,按照說明書將提取的RNA在一定的化學(xué)反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄條件下合成c DNA,在Real-time PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,記錄Ct值、擴(kuò)增曲線以及溶解曲線。并相對(duì)定量計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果(2-ΔΔCT)。5.Real-time PCR測定RNA干擾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響分別在成功轉(zhuǎn)染后1、3、5和7天提取各組細(xì)胞的RNA,同時(shí)提取正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的RNA作為對(duì)照組,按照說明書將各組的RNA在一定的化學(xué)反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄條件下合成c DNA后,在Real-time PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,記錄Ct值、擴(kuò)增曲線以及溶解曲線。并相對(duì)定量計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果(2-ΔΔCT)。6.Western blotting測定RNA干擾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響分別在成功轉(zhuǎn)染后1、3、5和7天提取各組細(xì)胞的蛋白,BCA測定蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、經(jīng)過一抗、二抗反應(yīng)后,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光,利用Image J軟件進(jìn)行條帶分析。用目的蛋白的灰度值除去內(nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差,所得結(jié)果代表樣品的目的蛋白的相對(duì)含量。結(jié)果 1.干擾序列的設(shè)計(jì)與合成針對(duì)大鼠Evi1的m RNA序列(Gene Accession No.:NM_001106423.1),人工合成2條si RNA序列,分別對(duì)5’-GGAAGCAACATGGAAACAA-3’位點(diǎn)進(jìn)行干擾的si Evi1-1:正鏈5’-GATCCGGAAGCAACATGGAAACAATTCAAGAGATTGTTTCCATGTTGCTTCCT TTTTTG-3’,反鏈5’-AGCTCAAAAAAGGAAGCAACATGGAAACAATCTCTTGAATTGTTTCCATGTT GCTTCCG-3’;和對(duì)5’-GCAGTGAGGTCTGCCATAA-3’位點(diǎn)進(jìn)行干擾的si Evi1-2:正鏈5’-GATCCGCAGTGAGGTCTGCCATAATTCAAGAGATTATGGCAGACCTCACTG CTTTTTTG-3’,反鏈5’-AGCTCAAAAAAGCAGTGAGGTCTGCCATAATCTCTTGAATTATGGCAGAC CTCACTGCG-3’。2.腺病毒干擾載體的構(gòu)建與作用實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了異位病毒整合位點(diǎn)的腺病毒干擾載體,而且對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞感染效率高達(dá)95%,干擾效率分別達(dá)到了90.9%和72.3%。3.RNA干擾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響分別用Real-time PCR和Western blotting對(duì)各組1、3、5和7天的成骨分化的標(biāo)志物BSP、OCN和OPN以及成脂分化的標(biāo)志物PPARγ2和LPL進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示:RNA干擾后細(xì)胞成脂分化的標(biāo)志物明顯降低而細(xì)胞成骨分化的標(biāo)志物明顯升高。結(jié)論成功構(gòu)建異位病毒整合位點(diǎn)的RNA干擾的腺病毒載體;成功轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并且具有很高的干擾效率。驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)的第二個(gè)假設(shè),為下一步實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。第四部分Sh Evi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞緩減大鼠骨質(zhì)疏松的作用目的建立大鼠骨質(zhì)疏松模型,在大鼠造模后7天將Sh Evi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過尾靜脈注謝的方法移植入骨質(zhì)疏松模型大鼠體內(nèi),注射后28天通過比較各組的骨密度(BMD)、I型骨膠原N-末端前肽(PINP)、I型膠原羥基未端肽(β—CTX)、和股骨生物力學(xué)指標(biāo)的變化,初步得出RNAi骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠有效緩解骨質(zhì)疏松進(jìn)程。方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周健康雌性Sprague Dawley(SD)大鼠40只,體重220-250g,由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。分為四組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.建立大鼠脊髓損傷模型骨質(zhì)疏松模型:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5%水合氯醛麻醉(0.6ml/100g,腹腔注射);然后采用腰椎后側(cè)正中切口,椎旁純性分離肌肉組織,切開腹膜,進(jìn)入腹腔。完整摘除雙側(cè)卵巢,給予傷口徹底的止血,逐層進(jìn)行縫合,假手術(shù)組手術(shù)操作同上,僅摘除卵巢周圍少許脂肪組織。3.尾靜脈注射Sh Evi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松在骨質(zhì)疏松模型后7天,通過尾靜脈注射的方法將Sh Evi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入大鼠骨質(zhì)疏松模型體內(nèi),對(duì)照組分別注射正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和L-DMEM培養(yǎng)基。4.Sh Evi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松的檢測4.1血清學(xué)測定大鼠尾靜脈注射治療后28日,取各組大鼠血液5ml離心后取血清用試劑盒對(duì)成骨標(biāo)志物和破骨標(biāo)示物進(jìn)行檢測。4.2骨密度測定使用雙能光子骨密度儀測量整個(gè)股骨干的骨密度。4.3生物力學(xué)測定取雙側(cè)股骨分別進(jìn)行三點(diǎn)彎試驗(yàn)試驗(yàn)。5.統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功本實(shí)驗(yàn)采用切除大鼠雙側(cè)卵巢這一成熟經(jīng)典造模方法,術(shù)后手術(shù)組大鼠較其它組體重增加,術(shù)后切口無感染,所有大鼠均存活。2.血清學(xué)測定結(jié)果使用上�？泼羯锟萍加邢薰镜膃lisa試劑盒對(duì)大鼠骨生成指標(biāo)Ⅰ型膠原N端前肽和大鼠骨吸收指標(biāo)β骨膠原交聯(lián)進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示:各組之間差異明顯,治療組優(yōu)于模型組,統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異;RNAi組優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.骨密度測定結(jié)果使用雙能光子骨密度儀測量股骨的骨密度結(jié)果顯示:兩治療組的骨密度較模型組有明顯提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,RNAi組優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組;但均低于正常對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.生物力學(xué)結(jié)果三點(diǎn)彎試驗(yàn)結(jié)果顯示:兩治療組生物力學(xué)測定值高于骨質(zhì)疏松模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論成功建立大鼠骨質(zhì)疏松模型;兩治療組中的大鼠骨質(zhì)疏松程度都一定程度上減輕,在緩解程度上Sh Evi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組優(yōu)于單純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組。Evi1基因有可能成為臨床治療骨質(zhì)疏松癥有效的藥物靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 原代培養(yǎng) 分化 鑒定 Evi1基因 成脂分化 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 RNA干擾 腺病毒轉(zhuǎn)染 骨質(zhì)疏松模型 I型骨膠原N-末端前肽 I型膠原羥基未端肽 生物力學(xué) 骨密度
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R580
【目錄】：

• 中文摘要6-16
• 英文摘要16-27
• 前言27-30
• 第一部分 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定30-39
• 1 材料和方法30-35
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30-31
• 1.2 主要儀器和試劑31-33
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法33-35
• 2 結(jié)果35-37
• 2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀測36
• 2.2 BMSCs表面標(biāo)記物的表達(dá)36
• 2.3 BMSCs成骨成脂誘導(dǎo)分化鑒定36-37
• 3 結(jié)論37
• 4 討論37-39
• 第二部分 Evi1基因在骨髓干細(xì)胞成脂分化中的表達(dá)特征39-49
• 1 材料和方法39-46
• 1.1 主要儀器和試劑39-41
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法41-46
• 2 結(jié)果46-47
• 2.1 Real-time PCR結(jié)果46-47
• 2.2 Western blotting結(jié)果47
• 3 結(jié)論47
• 4 討論47-49
• 第三部分 腺病毒載體構(gòu)建和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染49-65
• 1 材料和方法49-61
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物49-50
• 1.2 主要儀器和試劑50-51
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法51-61
• 1.4 統(tǒng)計(jì)處理61
• 2 結(jié)果61-62
• 2.1 干擾序列的設(shè)計(jì)與合成61
• 2.2 Evi1基因腺病毒干擾載體的構(gòu)建與作用61
• 2.3 Evi1基因?qū)MSCs分化的作用61-62
• 3 結(jié)論62-63
• 4 討論63-65
• 第四部分 Sh Evi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞緩減骨質(zhì)疏松的作用65-71
• 1 材料和方法65-68
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物65-66
• 1.2 主要儀器設(shè)備66
• 1.3 主要試劑66
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法66-68
• 1.5 統(tǒng)計(jì)方法68
• 2 結(jié)果68-69
• 2.1 骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功68
• 2.2 血清學(xué)測定結(jié)果68-69
• 2.3 骨密度測定結(jié)果69
• 2.4 生物力學(xué)結(jié)果69
• 3 結(jié)論69
• 4 討論69-71
• 參考文獻(xiàn)71-78
• 附圖和表78-94
• 綜述94-118
• 參考文獻(xiàn)106-118
• 致謝118-120
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果120-121
• 個(gè)人簡歷121

【相似文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：抑制Evi1基因表達(dá)促進(jìn)BMSCs成骨分化治療骨質(zhì)疏松癥的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：347102