肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是臨床上常見的惡性腫瘤之一,中國肝癌的新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。在我國,乙型肝炎病毒（HBV）感染是首要原因,并且超過80%肝癌病例是由慢性乙肝感染（慢乙肝）所導(dǎo)致。目前我們對乙肝病毒的致病機(jī)制還不完全清楚,慢乙肝以及慢乙肝所致肝癌仍是我國面臨的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。一方面,HBV病毒特異性感染肝細(xì)胞,在肝細(xì)胞中完成病毒自身復(fù)制等生命過程。HBV病毒的共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA（covalent closed circle DNA,ccc DNA）在宿主細(xì)胞中會與組蛋白纏繞,形成微小染色質(zhì)。ccc DNA微小染色質(zhì)是HBV病毒自身轉(zhuǎn)錄復(fù)制的模板,但是目前抗HBV藥物:核苷類似物（nucleoside analogue,NA）和α-干擾素（interferon-alpha,IFN-α）難以清除或有效抑制ccc DNA微小染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。目前我們對介導(dǎo)ccc DNA微小染色質(zhì)的形成、維持和表觀調(diào)控的分子機(jī)制了解有限,對HBV ccc DNA微小染色質(zhì)表觀調(diào)控機(jī)制的更深入研究十分必要和緊迫。另一方面,HBV病毒基因組也會整合進(jìn)入宿主... 

【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：137 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

核小體組蛋白KMT2s作用機(jī)制示意圖

2.3.12.2 原核表達(dá)質(zhì)粒引物設(shè)計(jì)Plasmid constructionHindIII-HA-RHBX-N-RHBX-M-RHBX-C-RHBX-M-α-helix-deletion-REcoRI-HBX-HindIII-FTACAAGCTTTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGACGTCGTATGGGTACCCGTGGTCGGTCGACGTCGTATGGGTAGAGTCCAAGAGTCCTCGACGTCGTATGGGTAGGCAGAGGTGAAAAAGTGACGTCGTATGGGTATTGGTGGGCGTTCAGGTGAATTCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCXbaI-WDR5-FXhoI-WDR5-RGAATCTAGAGATGGCGACGGAGGAGAAGAAGGTCCTCGAGTTAGCAGTCACTCTTCCACAGTTTA2.3.12.3 原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建引物設(shè)計(jì)合成→目的基因 PCR 擴(kuò)增、酶切/表達(dá)載體酶切、純化→載體與目的片段連→轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌→平板克隆→搖菌、質(zhì)粒純化、酶切鑒定→陽性克隆測序鑒定→高純度質(zhì)粒抽提。

圖 2.4.1.1 肝癌中 WDR5 蛋白檢測 2.4.1.1 (A) 免疫印跡檢測 WDR5 蛋白水平在正常肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞以及相應(yīng)癌旁組織中的。用免疫印跡法檢測不同組織的蛋白提取物，并用 WDR5 抗體進(jìn)行檢測。采用 GAPDH 作為蛋白。Ca，癌組織；P，腫瘤周組織；N，正常健康組織（n=16）；(B) 肝癌患者腫瘤組織和腫圍組織中 WDR5 蛋白的典型 IHC 染色，以及交通事故中肝破裂患者的正常肝組織 WDR5 蛋典型 IHC 染色。2.4.1.2 WDR5 高表達(dá)與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)那么，高表達(dá)的 WDR5 蛋白在 HBV 感染的肝癌病人中是否具有廣泛性呢？我集了 95 例既往確診肝細(xì)胞癌并且有明確的 HBV 感染臨床證據(jù)的手術(shù)病人標(biāo)本（包埋保存），通過 IHC 對此 95 例標(biāo)本進(jìn)行 WDR5 蛋白水平檢測（圖 2.4.1.2-A），其表達(dá)量高低進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（圖 2.4.1.2-B），發(fā)現(xiàn)在 95 例肝癌標(biāo)本中，WDR5 高表1%（39/95），中等表達(dá) 32%（30/95），低表達(dá) 27%（26/95）。這說明 WDR5 蛋白BV 感染的肝癌標(biāo)本中普遍高表達(dá)。根據(jù) IHC 中 WDR5 蛋白表達(dá)高低水平對這 95 人進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá) WDR5 的肝癌病人術(shù)后生存時(shí)間短于低表達(dá) WDR


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