肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是臨床上常見的惡性腫瘤之一,中國肝癌的新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。在我國,乙型肝炎病毒（HBV）感染是首要原因,并且超過80%肝癌病例是由慢性乙肝感染（慢乙肝）所導致。目前我們對乙肝病毒的致病機制還不完全清楚,慢乙肝以及慢乙肝所致肝癌仍是我國面臨的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。一方面,HBV病毒特異性感染肝細胞,在肝細胞中完成病毒自身復制等生命過程。HBV病毒的共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA（covalent closed circle DNA,ccc DNA）在宿主細胞中會與組蛋白纏繞,形成微小染色質。ccc DNA微小染色質是HBV病毒自身轉錄復制的模板,但是目前抗HBV藥物:核苷類似物（nucleoside analogue,NA）和α-干擾素（interferon-alpha,IFN-α）難以清除或有效抑制ccc DNA微小染色質的轉錄。目前我們對介導ccc DNA微小染色質的形成、維持和表觀調控的分子機制了解有限,對HBV ccc DNA微小染色質表觀調控機制的更深入研究十分必要和緊迫。另一方面,HBV病毒基因組也會整合進入宿主... 

【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學重慶市

【文章頁數(shù)】：137 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

核小體組蛋白KMT2s作用機制示意圖

2.3.12.2 原核表達質粒引物設計Plasmid constructionHindIII-HA-RHBX-N-RHBX-M-RHBX-C-RHBX-M-α-helix-deletion-REcoRI-HBX-HindIII-FTACAAGCTTTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGACGTCGTATGGGTACCCGTGGTCGGTCGACGTCGTATGGGTAGAGTCCAAGAGTCCTCGACGTCGTATGGGTAGGCAGAGGTGAAAAAGTGACGTCGTATGGGTATTGGTGGGCGTTCAGGTGAATTCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCXbaI-WDR5-FXhoI-WDR5-RGAATCTAGAGATGGCGACGGAGGAGAAGAAGGTCCTCGAGTTAGCAGTCACTCTTCCACAGTTTA2.3.12.3 原核表達質粒構建引物設計合成→目的基因 PCR 擴增、酶切/表達載體酶切、純化→載體與目的片段連→轉化感受態(tài)細菌→平板克隆→搖菌、質粒純化、酶切鑒定→陽性克隆測序鑒定→高純度質粒抽提。

圖 2.4.1.1 肝癌中 WDR5 蛋白檢測 2.4.1.1 (A) 免疫印跡檢測 WDR5 蛋白水平在正常肝細胞、肝癌細胞以及相應癌旁組織中的。用免疫印跡法檢測不同組織的蛋白提取物，并用 WDR5 抗體進行檢測。采用 GAPDH 作為蛋白。Ca，癌組織；P，腫瘤周組織；N，正常健康組織（n=16）；(B) 肝癌患者腫瘤組織和腫圍組織中 WDR5 蛋白的典型 IHC 染色，以及交通事故中肝破裂患者的正常肝組織 WDR5 蛋典型 IHC 染色。2.4.1.2 WDR5 高表達與生存時間呈負相關那么，高表達的 WDR5 蛋白在 HBV 感染的肝癌病人中是否具有廣泛性呢？我集了 95 例既往確診肝細胞癌并且有明確的 HBV 感染臨床證據(jù)的手術病人標本（包埋保存），通過 IHC 對此 95 例標本進行 WDR5 蛋白水平檢測（圖 2.4.1.2-A），其表達量高低進行了統(tǒng)計（圖 2.4.1.2-B），發(fā)現(xiàn)在 95 例肝癌標本中，WDR5 高表1%（39/95），中等表達 32%（30/95），低表達 27%（26/95）。這說明 WDR5 蛋白BV 感染的肝癌標本中普遍高表達。根據(jù) IHC 中 WDR5 蛋白表達高低水平對這 95 人進行生存分析，發(fā)現(xiàn)高表達 WDR5 的肝癌病人術后生存時間短于低表達 WDR


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